基因功能分析的基本策略.pptVIP

3）逆转录病毒感染法逆转录病毒载体的构建获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚外源DNA导入早期胚胎：01获得病毒颗粒感染早期胚胎02包装细胞与早期胚胎共培养感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育成携带外源基因的动物。03外源基因逆转录病毒载体逆转录病毒感染四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚嵌合小鼠纯合体小鼠逆转录病毒感染法的特点通过病毒DNA插入宿主DNA的机制，将外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率高。01反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(＜10kb)。02对家禽类的转基因研究有重要意义。034）精子载体法外源DNA01精子卵细胞受精卵转基因动物02共育法03脂质体转染法04电穿孔法05DNA精子受精卵DNA卵细胞DNA胚胎干细胞DNA逆转录病毒感染四细胞胚胎囊胚原肠胚转基因动物微注射显微注射3.下游—基因整合与表达检测及筛选STEP03STEP01STEP02染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。转录水平：转基因的mRNA的存在与否以及表达水平。蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。鉴定方法2Southernblot5RT-PCR3染色体原位杂交6Westernblot1PCR4Northernblot×转基因杂合鼠未转基因鼠生殖系细胞中不含转入基因生殖系细胞中含转入基因子代多次交配可得到纯合转基因鼠系三、转基因动物的应用分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能。建立人类疾病的转基因动物模型。基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。人类疾病的转基因动物模型A完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。B为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。C转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段。各种人类遗传病的鼠模型，如：老年性痴呆症(Alzheimer’sdisease)、关节炎(arthritis)、肌肉营养缺乏症(musculardistrophy)、肿瘤发生(tumorigenesis)、高血压(hypertension)、神经退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、内分泌功能障碍(endocrinologicaldisfunction)、动脉硬化症及其他很多疾病。利用转基因动物反应器生产药用蛋白转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物反应器等。01抗凝血酶III：转基因绵羊的乳汁中。02β乳球蛋白03红细胞生成素04凝血因子VIII05凝血因子IX06生长激素07转基因改良移植器官改造异种来源器官的遗传性状，使之适应于人体器官或组织的移植。011997年起，利用遗传改良的转基因猪肝做为严重肝病患者的离体生命支持物。02动物的克隆1996年，首次实现动物的无性生殖。01由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供细胞质发育而来。02核移植技术（NuclearTransfer)03第二节基因打靶STEP1STEP2STEP3基因打靶(GeneTargeting)：通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究此基因的功能。基因敲除(geneknockout):将某个基因定向去除。基因敲入(geneknockin):定向将一段基因序列替代另一段基因序列。一、基因打靶的基本程序01打靶载体的构建。03基因敲除ES细胞注射入胚泡。05嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。02打靶载体导入ES细胞及其鉴定。04胚泡植入假孕小鼠的子宫。同源基因片段质粒载体HB1HB2neor基因HSV-tk基因2.打靶载体导入ES细胞磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法显微注射法电穿孔法脂质体转染法打靶载体的正-负选择与整合位点两端区域同源的两段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor基因）。2个不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分别来自I型II型单纯疱疹病毒。02030401tk1HB1neorHB2tk2载体载体同源重组neorG418正筛选，细胞存活染色体染色体tk1HB1neorHB2tk2染色体染色体非特异性整合