《多光子激发光谱技术》课件.pptVIP

多光子激发光谱技术欢迎学习多光子激发光谱技术课程。本课程将深入探讨这一先进的光学技术，它已成为现代生物医学成像和材料科学研究的重要工具。我们将从基本原理出发，介绍实验装置、应用领域、技术发展趋势以及实用技巧，帮助您全面理解这一复杂而强大的研究方法。

课程概述课程目标掌握多光子激发光谱技术的基本原理与应用。建立对非线性光学成像技术的系统认识，培养实验设计与数据分析能力，为进一步研究打下坚实基础。主要内容课程分为八个部分，包括基本原理、实验装置、应用领域、发展趋势、实验技巧、应用案例、技术局限性以及未来展望。每部分将深入浅出地介绍相关知识点。学习成果

第一部分：多光子激发的基本原理1非线性光学现象多光子激发属于非线性光学现象，需要高强度激光使分子同时吸收多个光子。这种过程不同于常规的单光子吸收，具有独特的物理特性。2能量转换机制在多光子过程中，多个低能量光子的能量叠加，等效于一个高能量光子的作用。这使得可以使用长波长激光激发通常需要短波长光子才能达到的能级跃迁。理论发展历程

光与物质的相互作用单光子吸收在单光子吸收过程中，分子吸收一个具有适当能量的光子，从基态直接跃迁到激发态。吸收率与入射光强度成正比，表现为线性关系。这是传统荧光显微技术的基础。单光子吸收主要发生在紫外和可见光区域，对应的光子能量通常在2-3电子伏特范围内。多光子吸收多光子吸收是分子同时吸收两个或多个光子，这些光子能量之和等于能级差。吸收率与入射光强度的n次方成正比（n为吸收的光子数）。由于需要多个光子同时到达，这一过程只在极高光强度下才能高效发生，因此在空间上高度局限，提供了优异的三维分辨率。

多光子吸收过程双光子吸收双光子吸收是最常见的多光子过程，分子同时吸收两个能量相同的光子。激发率与光强的平方成正比，通常使用波长为700-1000nm的近红外激光。这使得成像深度更大，背景荧光更少。三光子吸收在三光子吸收中，分子同时吸收三个光子。激发率与光强的三次方成正比，对光强依赖更强。通常使用1000-1700nm的光源，穿透深度更大，但需要更高的激光功率。高阶多光子吸收四光子及更高阶的多光子吸收过程虽然理论上可行，但效率极低，需要非常高的激光功率。这些过程在特殊应用中具有潜力，可实现超深层组织成像，但目前研究相对较少。

多光子激发的特点123非线性过程多光子激发是典型的非线性光学过程，其效率与入射光强度的n次方成正比（n为吸收的光子数）。这种非线性特性导致只有在焦点处的光强足够高时才能有效激发荧光，使得激发体积极小。局部激发由于非线性特性，多光子激发仅在焦点附近的微小区域内发生，自然形成光学切片效果。这消除了传统共聚焦显微镜中需要的共焦针孔，简化了光路设计，并提高了光子收集效率。深度穿透多光子激发通常使用近红外激光，这一波长区域的光在生物组织中散射和吸收较少，因此可以穿透更深的样品。这使得对活体深层组织的成像成为可能，是该技术的重要优势。

多光子激发与单光子激发的比较比较方面多光子激发单光子激发空间分辨率固有的三维分辨率，只在焦点处激发需要共焦针孔实现轴向分辨率光漂白仅在焦点处发生，样品其他区域不受影响激发光路径上所有荧光分子都可能被漂白样品损伤光毒性局限于焦点附近，适合活体长时间成像整个光路径可能受到损伤，光毒性较大穿透深度可达数百微米甚至毫米级通常限制在100微米以内激发波长通常使用近红外波长通常使用紫外或可见光系统复杂度需要飞秒激光器，成本高可使用普通激光器，成本较低

多光子激发的量子力学描述跃迁几率根据量子力学理论，多光子激发的跃迁几率可通过高阶微扰理论计算。双光子跃迁几率正比于激光强度的平方和双光子吸收截面，后者描述了分子吸收两个光子的能力。多光子激发几率通常远低于单光子激发，这就是为什么需要高强度超短脉冲激光来实现高效的多光子激发。选择定则多光子跃迁的选择定则与单光子跃迁不同。例如，在具有对称中心的分子中，双光子允许的跃迁在单光子过程中可能是禁止的，反之亦然。这种选择定则的差异使得多光子光谱能够提供与单光子光谱互补的信息，有助于更全面地了解分子结构和电子态。

多光子激发的统计特性激发效率多光子激发效率与光子密度的n次方成正比，其中n为参与过程的光子数量。这种非线性依赖性导致只有在极短的脉冲持续时间和极小的焦点体积内才能达到足够高的光子密度。实际上，飞秒激光器的峰值功率可达到千瓦级，但平均功率仅为几十毫瓦，这种高峰值低平均的特性是实现高效多光子激发的关键。激发体积多光子激发体积由点扩散函数(PSF)的n次方决定，这使得激发体积比单光子过程小得多。理论上，双光子激发的PSF宽度比单光子过程减小约√2倍。激发体积的精确控制使多光子显微镜能够实现单分子水平的定位精度，以及对活细胞内亚细胞结构的高分辨率成像。

第二部分：多光子激发光谱技术的实验装置激光系统高性能飞秒