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摘要

miRNA的特点:MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。

本次试验用分子克隆的方法构建带有shRNA的pSuper载体经双酶切后电泳检测，并进行质粒DNA的抽提纯化和鉴定；用DNA-磷酸钙沉淀介导的转染法转染293细胞，经MTT、RT-PCR、Westernblot检测所获得的细胞株，构建含有人工合成shRNA与pSuper的载体，并将其转入人胚肾细胞中（293细胞），进一步观察shRNA的功能。结果：1.成功构建了含有shRNA的pSuper载体，经酶切鉴定，结果显示构建正确；2.获得了转染成功的293细胞；3.正确解释microRNA-X的功能。结论：本研究成功构建了含有shRNA的pSuper载体，并成功转进人胚肾293细胞，有效抑制相应蛋白的表达。

关键词：，pSuper载体，，microRNA-X，RT-PCR

目录

一引言（含miRNA相关资料）

二MicroRNA-X的克隆及其功能分析

1材料和方法

2结果和讨论

三结论

一引言

microRNA-X是近几年新发现的一类不编码蛋白质的单恋小分子RNA，这种小分子RNA通过互补配对原则作用于mRNA，由此影响蛋白质翻译过程引起基因沉默，其作用体现为在转录后水平对基因表达进行调控。

microRNA-X最为21世纪生命科学研究最为重大的发现，已经在短时间内成为了世界顶尖科学家研究的焦点，并迅速取得了另人瞩目的进展，短短几年关于microRNA-X的研究报道已近2000片。microRNA-X干扰这种独特的方式影响着生命活动中诸多方面，包括肿瘤的仿生、发展、耐药；胚胎的分化、发育；细胞的掉网；细胞抗病毒感染等方面。

我们的实验应用了基本生物信息学、基本的分子生物学实验技术和基本的细胞生物学实验技术，完成基因克隆和表达的完整工作。

microRNA-X的克隆与功能分析包括5个连续的实验：

人工合成shRNA与pSuper载体的体外链接与转化；

质粒DNA的抽提与鉴定；重组质粒DNA序列测定

转染真核细胞；MTT法检测对细胞活力的影响；

RNA的抽提纯化及逆转录PCR扩增目的基因

Westernblot对特定蛋白表达的检测

特定基因克隆的获得是研究其功能的前提。重组质粒经测序验证后经过质粒抽提，进行转染真核细胞，基于本实验涉及的质粒pSuper带有EGFP标记，可以在荧光显微镜下观察转染效率，通过MTT实验检测MicroRNA-X对过表达细胞活力的影响；通过RT-PCR检测MicroRNA-X对其特定靶基因的表达调控；进一步在蛋白质水平通过Westernblot进行验证。

二MicroRNA-X的克隆及其功能分析

1材料和方法

材料：

细胞株

人胚肾293细胞

质粒和菌株

pSuper载体和E.coliDH5α

分子克隆及转染试剂

限制性内切核酸酶

连接酶试剂盒

LB固体/液体培养基

质粒抽提试剂盒

Lipofectanmin2000

MTT

DMSO

Biowit钙转试剂盒

细胞培养试剂

DMEM-HG

小牛血清

胰酶

EDTA

100*双抗

RT-PCR实验试剂

无RNA酶水

Trizol试剂

氯仿、异丙醇、无水乙醇

甲醛变性电泳缓冲液

RNA电泳用加样缓冲液

逆转录反应试剂盒

dNTPmix、RNaseInhibitor、PCRkit试剂盒、oligoDt

电泳缓冲液5×TBE

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-印记法试剂

PMSF(苯甲基磺酰氟)

SDS（十二烷基磺酸钠）

丙烯酰胺

N,N,-亚甲