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牦牛奶中不同酪蛋白的提取及其功能特性分析

牦牛乳富含丰富的蛋白质、氨基酸、矿物质和维生素，具有易消化吸收和营养丰富等特点。牦牛乳的酪蛋白含量高，且酪蛋白组分丰富，具有良好的乳化性和发泡性。传统牦牛乳酪蛋白的分离提取主要采用沉淀法、等电点沉淀法、高效液相色谱分离等方法，存在产率低、工艺复杂、分离效果不理想等问题，难以满足工业化生产的需求。因此，本研究旨在为特色乳制品的深度开发和利用提供参考[1]。

1实验设计与方法

1.1实验操作步骤

1.1.1设计α-、β-、K-酪蛋白分离工艺流程

设计a-、β-、K-酪蛋白分离工艺流程，是实验中的关键步骤，需要考虑原料性质、分离方法和操作条件等。①将牦牛奶样品进行初步处理，去除杂质和沉淀物，采用离心法对牦牛奶样品进行预处理，去除脂肪和大分子蛋白。②对预处理后的样品进行pH调节，使其处于适宜的分离条件下。在分离过程中，采用钙盐沉淀法，通过添加0.1～0.5mol.L-1的CaCI2溶液，使酪蛋白沉淀，进而实现α-、β-、K-酪蛋白的分离。分离后的沉淀经过离心后，可得到不同酪蛋白的纯化产物。③根据实验需要，调节CaCl2的浓度，通常在0.1~0.5mol·L-1的范围内选择合适的浓度，调节溶液的pH为4.6~4.8,温度通常控制在4~10℃,以促进酪蛋白的沉淀和分离，保证实验环境的稳定性和分离效果的可靠性[2-3]。

1.1.2进行α-、β-、K-酪蛋白分离工艺的单因素实验

(1)调节CaCl2浓度对分离效果的考察。①准备一系列不同浓度的CaCl2溶液，浓度范围为0.1～0.5mol-L-1,再将这些溶液分别与牦牛奶样品混合，并进行离心分离过程。②离心后，沉淀物为0.1~0.5mol·L-1。其中，若CaCl2溶液≤0.1mol·L-1,表明浓度过低，无法充分沉淀酪蛋白，分离效果不佳；若CaCl2溶液≥0.5mol-L-1,表明浓度较高，会造成过度沉淀，使纯化产物中杂质含量超标，导致分离效果不佳。因此，保持CaCl2溶液浓度在0.1~5mol·L-1,即可实现高效、纯净的酪蛋白分离。

(2)调节冷却温度对分离效果的评估。调节冷却温度范围通常在4~10℃。通过观察可知，当冷却温度为4℃时，虽然沉淀质量评分较高，但分离纯度和上清液残留物质评分较低，表明低温下酪蛋白的沉淀速度较慢，导致分离时间延长，但同时也有利于提高分离纯度；当温度为10℃时，虽然沉淀质量较低，但分离纯度和上清液残留物质评分较高，因为高温度加速了沉淀过程，导致较多的杂质残留在产物中；当温度在6~8℃时，沉淀质量、分离纯度和上清液残留物质的评分都相对均衡，分离效果更佳，既能保证较高的分离纯度，又能控制残留物质的含量。

1.2利用SDS电泳方法评估牦牛奶中α-、β-、K-酪蛋白的纯度

样品制备过程如下。①取出待分析的样品2mg,然后放入一个容量为1.5mL的离心管中。按照1:4的比例，向离心管中加入4倍样品重量的纯水，使样品得以溶解。例如，如果样品为2mg,则需要加入8mL的纯水。②待样品充分溶解后，从中取出20μL的溶液，转移到另一个离心管中。在新的离心管中，向样品溶液中加入20μL的β-巯基乙醇(β-ME)、15μL的饱和溴酚蓝溶液，用于反应和标记样品的试剂。③混合均匀后，将混合溶液置于金属浴中，设定温度为95℃,并进行反应处理，持续时间为10min,处理完成后，备用样品可用于后续的分析实验中。

电泳分析牦牛奶酪蛋白组分纯度的具体步骤(见表1)。

表1电泳分析牦牛奶酪蛋白组分纯度步骤表

1.3测定牦牛奶酪蛋白组分的功能特性

1.3.1溶解性的测量方法

称取2mg的酪蛋白样品，将其溶解在水中或者缓冲液溶剂中，在室温或者37℃条件下观察其溶解过程。在溶解过程中，轻轻摇晃溶液，以促进酪蛋白的充分溶解。同时，技术人员需要观察溶液的透明度和均匀性，确保酪蛋白能够完全溶解，不产生任何沉淀或凝固物。

1.3.2乳化性的检测程序

根据实验设计和所需乳化性能，取2mg的酪蛋白样品，溶解于pH5.5~7.0、1.5mL的缓冲液中。准备1:1的油相和水相，将酪蛋白样品溶液加入油相和水相中，轻轻搅拌使其充分混合。观察乳液10min,看其是否形成了稳定的乳液，并详细记录乳液的外观、稳定性以及乳化度等参数[4]。

2实验结果与分析

2.1牦牛奶中α-、β-、K-酪蛋白的提取与分离效果

2.1.1钙离子浓度调节实验结果分析

一方面，a-CN具有较多的磷酸丝氨酸基团，在碱性条件下带有更多的负电荷，与钙离子结合的能力更强。随着Ca2+浓度的增加，其与