分子诊断技术在结核病诊治中的应用.pptVIP

MTBDRsl-鉴定XDRMTBDRplus-鉴定MDRMTBC-鉴定MTB复合群MTBCM-鉴定MTB和NTM分类Gene-Probe(TMA/Hain)技术MTBC-鉴定MTB复合群(TMA技术)HPV（HybridizationProtectionAssay）-杂交保护分析法为Gen-probe公司专利方法名称：以rRNA为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群原理：LEADER50iHPA-MTD(MycobacteriumTuberculosisDirect):5h报告，直接从标本中检测结核菌检测设备：1h报告，用菌落或自动培养系统的菌HPA-Accuprobe:MTD技术路线样本细胞溶解目标r-RNA释放杂交体rRNAAEAEAEAEAEAEAEAE60°C15分钟加入探针探针杂交AEAEAE选择性试剂60°C化学发光读数仪荧光检测MTD技术特点MTD结核分枝杆菌检测技术特点采用分子技术快速鉴定（2.5小时）结核分枝杆菌复合群标本可以是涂片阴性或者阳性的痰标本；也可以是培养物唯一获得FDA推荐的凃阴样本快速检测技术检测RNA，RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人）采用TMA恒温扩增，不使用PCR仪器，无需专业的PCR实验室认证HPA杂交保护分析技术：灵敏、特异严格的实验室防污染技术：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）TB与其他分枝杆菌区分长期低热、ESR持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、痰TB菌MTD检测疑似患者CSF、胸腹水等提高TB检出率MTD结核分枝杆菌的直接检测意义DNA作为临床分子诊断靶标四、MTBDRplus-鉴定MDR方法名称：耐多药结核病(MDR-TB)快速诊断为HainLifescience公司专利原理：采用线性探针技术（Line-Probe或称DNA-Strip）检测结核分枝杆菌复合群利福平(rpoB)和异烟肼(katG和inhA)等结核治疗药物的耐药基因来判断TB体内耐药性MTBDRplus:6h报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果结核耐药的分子机制MTBDRplus技术路线DNA提取PCR扩增探针杂交结果判读结果解释野生型：有杂交带显色为“+”，表示未发生突变耐药突变位点：有杂交带显色为“+”，表示发生突变敏感：所有野生型探针“+”和所有耐药位点探针“-”耐药：对应药物有1条野生型探针“-”或有1条耐药位点“+”MTBDRplus技术优势快速检测RFP和INH的耐药时间短、操作简单、安全高特异性和灵敏度较高、重复性好主观因素影响小、更为可靠不足不能检测所有药物的耐药基因型缺少ahpC-oxyR间隔序列范围不能取代传统细菌学检测、只能作为参考技术特点MTBDRplus技术性能参数logoJClinMicrobiol.2010Aug;45(8):2635-40.Epub2007May30MTBDRplus技术性能参数中国人群存在一定数量的KatGS315N突变WHO、盖茨基金会推荐使用的快速线性探针技术，可以在6小时内给出药敏鉴定结果可以做一线结核药物（异烟肼利福平）、二线结核药物的耐药检测（乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、可注射结核药物）标本可是涂片阳性的痰标本，或是培养物技术步骤简单：核酸提取、PCR扩增、核酸杂交仪检测每个试剂条上自带质控：CC杂交质控、AC扩增质控、TUB结核分枝杆菌质控，确保整个实验流程的可信度HAIN-结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点五、交叉引物恒温扩增技术(CrossPrimingAmplification,CPA)本试剂盒将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异性引物、一对特异性探针，同时一次性完成TBDNA的扩增及杂交过程，然后用3号一次性核酸检测装置对TB感染进行定性诊断，其检测灵敏度为10个病原体，高特异引物设计确保了结果的可靠性。由于待测样本的扩增（PCR管盖和石蜡油双重保护）和检测过程均在物理封闭条件下完成，所以本试剂盒具有防止实验室扩增物交叉污染，防止假阳性的效果杭州优思达公司CPA技术原理图引入交叉引物位点交叉引物扩增检测产物CPA技术路线图核酸提取痰液石蜡油反应液试剂配制63±2℃恒温扩增金属浴防污染检测装置取出反应管15-