细胞培养的必备设施常用器材.ppt

细胞培养器械、用液的配制和消毒;本次课内容;一、细胞培养的必备设施;;;;;（二）超净工作台;（三）恒温培养箱

变通电热恒温培养箱

CO2培养箱;(四)其他设备

倒置显微镜

电热鼓风干燥箱

电子天平

恒温水浴箱

离心机

压力蒸汽消毒器

液氮储存罐

;;;酶标仪;;第三节细胞培养常用器材

和培养基;一、常用器材;;;;;;一般螺口瓶;螺口刻度血清瓶;中间螺口刻度离心管;;（二）金属器材;二、细胞培养常用器材清洗措施;（二）塑料器材的消毒处理措施

用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜（单用或交叉处理），水洗，单蒸水，三蒸水浸泡过夜，凉干，紫外线或辐射灭菌

（三）橡皮器材（多种瓶或试管的塞子、盖子）

5%NaOH煮，水洗，4%盐酸煮，水洗8~10次，单蒸水洗三次、二蒸水洗一次。;（四）金属器材（剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及多种型号针头等）

纸擦去表面的油脂，洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟，水洗，95%酒精纱布擦干，包装灭菌??;二、灭菌

试验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃,15lb,20分钟，置于oven中烘干。

试验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170℃,4小时。

吸管、培养瓶、手术器械等置饭盒内高压蒸汽灭菌121℃,15lb,20分钟，置于oven中烘干。

液体用10%蒸汽高压灭菌121℃,15lb,20分钟处理。;三、常用溶液、培养液及其配制;磷酸盐缓冲液（PBS）

甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液

磷酸氢二钠(无水)28.4g氯化钠8.77g

加去离子水或双蒸水至1000mL

乙液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液

磷酸二氢钠(无水)2.4g氯化钠8.77g

加去离子水或双蒸水至1000mL

甲、乙液于4℃保留，使用时按比例配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保留。;Hanks液

(1)母液甲(20x)配法

①NaCl(A.R)160g

KCl(A.R)8g

MgSO4.7H2O（A.R)2g

MgCl.6H2O(A.R)2g

依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。

②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不停搅拌（此液应单配，单溶）。

混合上述两溶液双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保留。;(2)母液乙(20×)配法

①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g

KH2PO4(A.R)1.20g

葡萄糖(A.R)20.0g

溶于800ml双蒸水中。

②0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01NNaOH11.28mL，加水至100mL，过滤

用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置4℃保留。

（3）使用液（1×）配法

取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，以115℃高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)，置室温后4℃保留;（二）培养基（维持液、营养液）

目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择，重要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他某些辅助物质。;粉末培养基配制(以1升为例)：

取粉末培养基溶于800mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。

称取适量之NaHCO3粉末溶于水中，搅拌使其溶解

混后溶液之pH应为7.2-7.4，pH试纸检测。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。（培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2）补水至900ml。

以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同步分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)

;液体培养基贮存于4℃冰箱，防止光照，试验进行前放在37℃水槽中温热。

液体培养基(加血清)寄存期为六个月，期间glutamine也许会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。;（三）血清

血清必须贮存于–20～-70℃，若寄存于4℃，请勿超过一种月。

一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

瓶装(500ml)血清解冻环节(逐渐解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度变化太大，轻易导致蛋白质凝结