荧光定量原理扩增曲线.ppt

TIANGEN公司荧光定量产品优势试剂盒中使用改良后的HotmasterTaqPolymerase，具有高效率、高灵敏度、高特异性特点多种不同的实验缓冲液，满足不同实验需求高效的Quant系列逆转录酶，满足RT需求独特的Mg2＋自动调节，随时保证为PCR提供最佳Mg2＋浓度第54页，共55页，星期日，2025年，2月5日*感谢大家观看第55页，共55页，星期日，2025年，2月5日****************************************rRNA丰度高，占总RNA的80%，研究表达丰度较高的基因时比较适合；rRNA转录调节受其它因素影响，如28s和18srRNA在有细分裂期间表达量明显减少或停止表达，所以在研究与细胞周期相关的基因时就不适合以此为内参；另外，由于表达量较高，在研究丰度相对较低的基因时，有时就不太适用，比如Multiplex。当然也有rRNA的忠实拥护者，有人认为表达量高才时定量准确的关键，总之各有说法，但选择看家基因最关键的地方还是看该基因在你所研究的体系下是否稳定表达，可通过选择两个看家基因在不同的处理间相互比较，看两者比值是否恒定，如果一致，那么他们都可用作这个实验的看家基因。****3’淬灭基团淬灭基团性质建议使用的5’报告基团TAMRA荧光物质FAM,HEX,TET,JOE等Eclipse非荧光物质FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等Taqman探针法——荧光标记物的选择第22页，共55页，星期日，2025年，2月5日高度特异性重复性好可进行多重定量优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点Taqman探针法——优缺点第23页，共55页，星期日，2025年，2月5日不同定量方法的比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带不能进行多重定量适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好多重定量价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断第24页，共55页，星期日，2025年，2月5日内容概要荧光定量PCR原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南第25页，共55页，星期日，2025年，2月5日绝对定量解析方法第26页，共55页，星期日，2025年，2月5日Sample25绝对定量的定义Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量第27页，共55页，星期日，2025年，2月5日质粒标准品的制备PCR目的基因克隆质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA第28页，共55页，星期日，2025年，2月5日拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算第29页，共55页，星期日，2025年，2月5日方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取HBVDNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确c