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重组DNA技术与基因工程

1重组DNA技术与基因工程的基本概念

2重组DNA技术所需的基本条件

3重组DNA技术的操作过程

4目的基因的克隆与基因文库的构建

5外源基因在大肠杆菌中的表达

6外源基因在酵母中的表达

7动植物的基因工程

6外源基因在酵母中的表达

A酵母作为表达外源基因受体的特征

酵母的分类学特征

酵母（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞

真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母）、担子菌纲（担子酵母）、

半知菌类（半知酵母），共由56个属、500多个种组成。如果说大肠

杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真

核生物表达系统。

6外源基因在酵母中的表达

A酵母作为表达外源基因受体的特征

酵母表达外源基因的优势

全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便

具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统

大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉

能将外源基因表达产物分泌至培养基中

不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的

基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRA

酵母菌是最简单的真核模式生物

6外源基因在酵母中的表达

B酵母的宿主系统

・广泛用于外源基因表达的酵母宿主

♦提高重组蛋白表达产率的突变宿主

♦抑制超糖基化作用的突变宿主

•减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主

广泛用于外源基因表达的酵母宿主

目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母包括:

酵母属如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)

克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)

毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)

裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)

汉逊酵母属如多态汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)

其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母

表达外源基因最理想。

提高重组蛋白表达产率的突变宿主

能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型:

突变类型生物效应作用位点

C1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶

ssc2提高重组蛋白表达转*后加工

切提高重组蛋白表达转录水平

ose1提高重组蛋白表达转录水平

C11改善重组蛋白分泌竣肽酶丫

rho~提高重组蛋白表达转录水平

抑制超糖基化作用的突变宿主

许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们

常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分

组成。

能抑制超糖基化的突变类型

酵母菌普遍拥有蛋白_____________________________________

质的糖基化系统，但野生突变类型生物效应

型酿酒酵母对异源蛋白的