DB37T 2841-2016 鸭坦布苏病毒半套式RT -PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

DB37

山东省地方标准

DB37/T2841—2016

鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法

DetectionmethodonduckTembusuvirusbysemi-nestedRT-PCR

2016-09-18发布2016-10-18实施山东省质量技术监督局发布

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DB37/T2841—2016

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。

本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、陈浩、冯强、提金凤。

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DB37/T2841—2016

鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)检测方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。

本标准所规定的鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法适用于检测鸭组织、分泌物、排泄物和禽胚尿囊液中坦布苏病毒的核酸，也适用于鹅和其他动物坦布苏病毒核酸的检测。

2实验室条件

2.1仪器

生物安全柜、PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器等。

2.2操作区域

样品操作区要有相应的生物安全设施；样品操作区、RNA提取区、PCR扩增区、电泳区应单一方向，不得倒流；电泳区与其他操作区域相互隔离。

2.3操作者

操作者应接受过实验室生物安全培训、分子生物学实验室检测技术培训。熟悉防止RNA降解、核酸污染和溴化乙锭污染的具体措施；熟悉RT-PCR检测结果的判断方法。

3试剂的准备

3.1试剂

3.1.1商品化的RNA提取试剂盒。

3.1.2rTaqDNA聚合酶(5U/μL);

3.1.310×PCRBuffer;

3.1.4M-MLV反转录酶(200U/μL);

3.1.55×M-MLVBuffer;

3.1.6dNTPs(2.5mmol/L,10mmol/L);

3.1.7RNA酶抑制剂；

3.1.81.5%琼脂糖凝胶，见A.1;

3.1.91×TAE缓冲液，见A.2;

3.1.10溴化乙锭(10μg/μL),见A.3;

3.1.11核酸电泳加样缓冲液，见A.4;

3.1.12商品化的DNA分子量标准，要求在100bp~2000bp之间，有5条以上的指示条带；

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3.1.13已知的坦布苏病毒鸭胚尿囊液制作的阳性对照标准品；

3.1.14用高压灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。

3.2引物

反转录所需随机引物

RandomPrimer(9mer),引物浓度为100μmol/L。

检测所需引物

上游引物5455F:5-ATGGATGAAGCYCATTTCAC-3;

下游内侧引物5371R:5-CCAAAGTTGGCYCCCATCTC-3’;

下游外侧引物5861R:5-AGCACACGGCAATCTCAT-3’,扩增片段长度为277bp。引物浓度为100μmol/L。

4操作程序

4.1样品的采集和处理

4.1.1样品的采集

死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。

4.1.2样品的保存

样品应放在含有抗生素的pH值7.0~7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS,附录B.1)内(无PBS可用25%~50%甘油盐水，见附录B.2)。抗生素的选择视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素(2000IU/mL),链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL),加入抗生素后pH值应调至7.0~7.4。在室温放置1h~2h内样品应尽快处理，不能处理的可在4℃存放24h,也可于低温条件下保存(-70℃贮存最好)。

4.1.3病料的处理

样品处理在生物安全柜中进行，咽喉或泄殖腔拭子，置于200μL含有抗生素的pH值7.0~7.4等渗磷酸盐缓冲液中；研碎的组织用含抗生素pH值7.0~7.4的等渗PBS溶液配成10%～20%(g/mL)的悬液。样品液经8000r/min离心10min,取上清液作为检