分子生物学常用技术上.pptVIP

5’保护碱基+酶切位点+起始密码+目的基因5’末端序列3’1atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccaga451MNFQQRLQSLWTLAR15上游引物5’cgggatccatgaattttcaacagaggctg3’BamHI上游有标签读框586cttctgacctggatgcagaaattctacaagctctga621196LLTWMQKFYKL*下游引物:反向互补5’保护碱基+酶切位点+终止密码+目的基因3’末端反向互补序列3’5’ccgctcgagtcagagcttgtagaatttctg3’XhoI下游有标签读框退火温度1)T=2×(A+T)+4×(G+C)-3~52)T=22+1.46ln±3~5ln=2(GorC)+(AorT)20~35nt3)T=81.5+16.6lg[J+]+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%)[J+]=monovalentcationsl=oligonucleotidelengthFA=formamide14~70nt55℃调整温度(2~3℃)温度高，特异性高DNA相对分子质量DL2000;PCR产物;PCR空白对照。图PCR产物电泳结果(1.5%Agarose)a.样品准备区：提取核酸,在没有DNA的干净环境中进行PCR实验室b.前PCR区：加样区，配制所用的试剂。c.后PCR区：反应后处理样品这一区域的所有试剂和仪器不能用于任何前PCR活动注意事项a.阴性(无模板)、阳性对照(阳性模板)b.配制PCR混合物：PCRbuffer+dNTP+H2Oc.控制污染:靶序列污染，气溶胶实验室分区；紫外线(距离1m，400μW/cm2)照射；更换试剂；换仪器；换实验室；用另一套引物；用化学法修饰DNA；停试验。限制性核酸内切酶：识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ同一种微生物中分离多种限制酶的顺序命名原则EcoRI属的缩写种的缩写不同变种和品系的缩写“发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用”1978年诺贝尔生理或医学奖WernerArberDanielNathansHamiltonOSmithKaryB.MullisMichaelSmithPCR和定点突变突变1993年诺贝尔化学奖“发明了聚合酶链反应(PCR)的方法”“开创了基于寡聚核苷酸的定点突变方法及其在蛋白质研究中的发展”(1)PCR发展史1.1983年春，Mullis提出PCR的概念；2.1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做第一个PCR实验，只一个循环；3.1983年12月，同位素标记的10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；4.1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；5.1985年10月25日申请PCR专利，1987年7月28日批准(专利号4,683,202），这次Mullis是第一发明人。6.1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界开始学习PCR方法；7.1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，这是1985年春天Mullis建议做的；8.1988年，第一台PCR仪问世；9.1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元代价从Cetus公司获得全权开发权。10.1993年，Mul