DB37T 3086-2017 猪附红细胞体PCR检测技术　　.docxVIP

ICS65.020.30

B41

DB37

山东省地方标准

DB37/T3086—2017

猪附红细胞体PCR检测技术

PCRAssayforDetectionofSwineEperythrozoon

2017-12-29发布2018-01-29实施

山东省质量技术监督局发布

I

DB37/T3086—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。

1

DB37/T3086—2017

猪附红细胞体PCR检测技术

1范围

本标准规定了猪附红细胞体PCR检测技术的操作要求

本标准适用于猪附红细胞体的实验室诊断、监测和流行病学调查等。

2实验室生物安全要求

实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。

3规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

4术语与定义

下列术语与定义适用于本标准。

4.1

PCR

聚合酶链式反应。

4.2

SDS

十二烷基硫酸钠。

5仪器设备和试剂

5.1仪器设备

5.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。

5.1.220000r/min低温高速离心机。

5.1.3电热恒温水槽。

5.1.4稳流稳压电泳仪。

5.1.5水平电泳槽。

5.1.6凝胶成像系统。

5.1.7紫外透射反射分析仪。

5.1.8电磁炉。

5.1.9烧杯(1000mL)。

2

DB37/T3086—2017

5.1.10电子天平精度为：0.001g。

5.1.11PCR扩增仪。

5.1.12-20℃冰柜。

5.1.132℃~8℃冰箱。

5.2试剂

除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。

5.2.1蛋白酶K(见附录A.1)。

5.2.210%SDS液(见附录A.2)。

5.2.370%乙醇(见附录A.3)。

5.2.41.0%琼脂糖凝胶(见附录A.4)。

5.2.5DNAMarkerDL2000。

5.2.6超纯水：符合GB/T6682,三级。

5.2.7引物：

MS-Fwd:5-CGAGCGCAACCCTTCATAT-3;

MS-Rev:5-CTACCATTGTAGCACGTTTGCA-3;扩增片段大小127bp。

6操作程序

6.1样品的采集和处理

6.1.1样品的采集

临床上猪的血液(肝素抗凝血),置于2℃~8℃冰箱保存。

6.1.2样品的处理

6.1.2.1取肝素抗凝血液约5ml。

6.1.2.2阳性对照处理：猪附红细胞体DNA。

6.1.2.3阴性对照处理：灭菌双蒸水。

6.2DNA的提取

用蛋白酶K裂解法提取总DNA。

6.2.1取肝素抗凝血500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的SDS溶液25μL,55℃水浴2h～3h。

6.2.2加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min。

6.2.3取上清于一新的离心管中，加入200μLTris饱和酚和200μL氯仿，10000g离心15min。

6.2.4取上清于一新离心管中，加入200μL氯仿，10000g离心15min。

6.2.5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min,10000g离心15min,弃上清。

6.2.6加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。

6.2.7加入100μL灭菌双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用。试验中同时设立猪附红细胞体DNA作为阳性对照和