微生物培养基配制及菌种管理作业指导书草稿.pdf

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培养基配制及标准菌种的管理作业指导书

HB-CZ-085

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培养基配制及标准菌种的管理作业指导书

1适用范围

本作业指导书适用于无菌实验室培养基配制和标准菌种、参照菌种的管理。

2内容

2.1培养基配制

2.1.1实验室中各种培养基按实验需要进行配制，每次配制应有记录。

2.1.2配制好的培养基，不宜存放过久，以少量勤配为宜，存放于0～4℃，可保存7天。

2.2标准菌种的管理

2.2.1实验室内保存的标准菌种必须从认可的收集途径获得。

2.2.2标准菌种必须进行确认试验。

2.2.3菌种传代

从供应商处购买的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为

第1代，直至到第3代为工作菌种。按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的营

养琼脂培养基内，作为第一代。经菌种特性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备

甘油冷冻管，作为第二代。将第二代保存，另取1支第二代冷冻保存管转种于平板和斜

面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）；斜面养基适当温度培养后作为

工作用菌种（第三代）。将（第三代）菌种冷冻或低温保存用于试验。应及时进行菌种

传代，避免菌种失活老化。当工作菌种代数小于5时，可直接用上代工作菌种转接下代

工作用菌种。转接第四代，直至四代转为五代。标准菌种的传代次数不得超过5代。

2.2.4菌种确认

每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试

验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。用于总大肠菌群和粪

大肠菌群项目检验的大肠埃希菌的特性如下：

2.2.4.1形态特征：G-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能运动。有菌毛。

2.2.4.2培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成

较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落。

2.2.4.3分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板）上呈现深紫黑色，具有金属光泽的菌

2.2.6.3关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿

接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返

通过三次

2.2.6.4右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再

轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔

上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方

2.2.6.5塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，

照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后

从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上

2.2.6.6取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在

火焰上烧灼灭菌

2.2.6.7将已接种好的细菌管置35～37℃培养箱培养22～24h

2.2.7菌种保存

2.2.7.1斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保

藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续

大肠埃希菌可在营养琼脂培养基上4℃～6℃斜面保存2～3个月

2.2.7.2甘油冷冻管保藏法

将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜温度下培养适宜时间后，用无菌接

种环轻轻刮取菌苔，通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试

管中的无菌蒸馏水中，调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管，向已制备好

的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。轻轻振摇小管，

使内容物充分混合，分装于无菌小管，最好在-30℃条件下储存，一般可保存2年

3记录

培养基配制记录包括配制日期、培养基类型、体积、成分、pH值、灭菌条件、无菌

检验、制造商、批号及配制人员

标准菌种的管理记录包括菌种编号、名称、来源、保存条件、确认试验

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