聚合酶链反应技术及应用.pptVIP

**经济**（三）多重PCR（multiplexPCR）PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率低。为提高效率，常采用多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。**用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物**（四）锚定PCR（anchoredPCR，APCR）用于扩增已知一端序列的目的DNA**引物a引物c引物b引物d53PCR混合，变性和复性延伸异源部分双链DNA形成5555’533333333333555555PCR引物a引物d再次PCR5533（五）重组PCR（recombinantPCR）**（六）不对称PCR（asymmetricPCR）其基本原理是：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50～100:1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA（ssDNA）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列的要求。**已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切点（X）限制酶切点（X）限制酶X酶切连接未知序列（七）反向PCR（inversePCR）**（八）定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，QPCR）1．PCR定量DNA一个或两个拷贝的特定靶序列的细胞株即是标准的一个理想来源，也可使用含特定靶序列的质粒DNA作为对照，将待检样品与一系列稀释的标准对照一起扩增，检测PCR产物，即可推知靶序列的含量。2．PCR定量mRNA(1)mRNA相对定量(2)竞争性PCR定量mRNA(3)cRNA标准曲线法定量mRNA**log[DNA]Cycles不同样品有不同的生成曲线**普通PCR和定量PCR的区别适用定性分析，不适合定量分析；PCR产物的长度从100bp－数kb实时检测:每个循环都产出荧光信号，可绝对定量，灵敏度更高PCR产物的长度一般在60-150bps**荧光定量聚合酶链反应技术**荧光定量PCR（FluorescenceQuantitivePolymeraseChainReactionFQ-PCR）基于荧光能量传递技术（FluorescenceresonanceenergytransferFRET）,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色团转移到受体发色团,转移效率与两个发色团之间距离的6次幂倒数成比例，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。在PCR反应体系中，FQ-PCR的荧光标记物可分为两种：荧光染料标记和荧光探针标记。**常规PCR常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性分析S1S2MDNAEngine**通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析荧光定量PCR荧光信号如何产生？如何对初始模板定量?RealtimePCR实时监测系统**线性基线期：扩增最初的10～15个循环，此时，PCR反应处于起始阶段，扩增产物很少，产生的荧光信号很低；指数期初期：进入指数期初期，荧光强度达到一个阈值,为基线荧光信号均值标准差的10倍。指数期：PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每循环一次，产物倍比增加。平台期：此时荧光信号不再随扩增循环数的增加而增加。PCR扩增的4个主要阶段**Ct值:PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时，达到一个人为确定的阈值所对应的循环次数。Ct值的概念ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04阈值线Ct值Ct值如何对初始模板定量？****荧光定量PCR原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量