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基因工程和细胞工程整理后的知识点

??##一、基因工程

（一）基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。

（二）基因工程的基本工具

1.限制性核酸内切酶（限制酶）

来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。

2.DNA连接酶

作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，即将脱氧核糖和磷酸连接起来，形成磷酸二酯键。

种类：

E·coliDNA连接酶：来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来。

T4DNA连接酶：来源于T4噬菌体，既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率比较低。

3.载体

作用：携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。

具备的条件：

能在受体细胞中复制并稳定保存。

具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

种类：

质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

λ噬菌体的衍生物：改造后的λ噬菌体，可作为载体。

动植物病毒：如逆转录病毒等，可用于基因工程。

（三）基因工程的基本操作程序

1.目的基因的获取

从基因文库中获取

基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

种类：

基因组文库：包含一种生物的全部基因。

部分基因文库：如cDNA文库，只包含一种生物的一部分基因，是由mRNA逆转录形成的DNA片段构建而成。

利用PCR技术扩增目的基因

原理：DNA双链复制。

条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等。

过程：

变性：当温度上升到9095℃时，双链DNA解聚为单链。

复性：温度下降到5560℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

延伸：温度上升到7075℃时，Taq酶从引物的3′端开始延伸DNA链，合成互补链。

特点：指数形式扩增，可在短时间内大量扩增目的基因。

人工合成：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

2.基因表达载体的构建

基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。

启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。

标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因等。

构建过程：

用一定的限制酶切割载体，使载体出现一个切口，露出黏性末端。

用同种限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。

将切下的目的基因片段插入载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成重组DNA分子。

3.将目的基因导入受体细胞

植物细胞

农杆菌转化法：农杆菌中的Ti质粒上的TDNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。将目的基因插入到Ti质粒的TDNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。

花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

动物细胞

显微注射技术：将含有目的基因的表达载体提纯，用显微注射仪注射到受精卵中，再将受精卵送入母体内，使其发育成具有新性状的动物。这是目前转基因动物中采用最多、最有效的方法。

微生物细胞

原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。

转化方法：用Ca2?处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。然后将重组表达载