分子生物学基本操作技术.ppt

5’3’5’3’5’3’RQ延伸1、鏈的合成起始Taq5’3’3’QTaqR5’2、切割和鏈置換3、鏈合成結束5’3’QTaqR3’5’4、檢測5’3’3’QTaqR5’l5’3’5’3’QR退火六、DNA測序技術1.Sanger雙去氧鏈終止法原理：核酸範本在核酸聚合酶、引物、四種單去氧堿基存在條件下複製或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙去氧堿基，只要雙去氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單去氧堿基的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端，以雙去氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後，分四個泳道進行電泳以分離長短不一的核酸片段（長度僅差一個堿基），根據片段3’端的雙去氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。原理：將一個DNA片段的5端磷酸基作放射性標記，再分別採用不同的化學方法修飾和裂解特定堿基，從而產生一系列長度不一而5端被標記的DNA片段，這些以特定堿基結尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的DNA的堿基序列。堿基體系化學修飾試劑化學反應斷裂部位G

A+G

C+T

C

ACdimethylsulphate（硫酸二甲酯）

Piperidineformate（呱啶甲酸）,pH2.0

hydrazine（肼，聯氨NH2.NH2）

hydrazine+NaCl（1.5M）

90?C,NaOH（1.2M）甲基化

脫嘌呤

打开嘧啶环

打开胞嘧啶环

斷裂反应G

G和A

C和T

C

A和C2.Maxam－GilbertDNA化學降解法相同點：都生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸。每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止於一種特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長度各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由這個特定堿基在待測DNA片段上的位置所決定。然後通過高解析度的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，從放射自顯影膠片上直接讀出待測DNA上的核苷酸順序。3.重亞硫酸鹽測序技術——DNA甲基化研究原理：重亞硫酸鹽能夠使DNA中未發生甲基化的C脫氨基變為U，而甲基化的C則保持不變。經PCR擴增後，該U被測序儀讀作T。通過與未經重亞硫酸鹽處理的序列進行比較，就能夠判斷某位點是否發生甲基化。（p182）優點：能夠明確目的片段中每一個位點的甲基化和非甲基化狀態，可靠性和精確性高。缺點：耗時耗資過多，每一個目的片段至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數據。在甲基化變異細胞占少數的混雜樣品中，靈敏度較差。七、基因組DNA文庫的構建基因組DNA文庫（GenomicDNAlibrary）:是指將某種生物的基因組DNA用限制性內切酶或機械切割法切成適當長度的DNA片段，再與合適的載體在體外重組並轉化相應的宿主細胞，形成克隆。彙集某種生物全部遺傳資訊（基因組DNA中所有序列資訊）的重組DNA分子的克隆總和，就稱為該生物基因組DNA文庫。可用於保存某種生物的全部基因、分離特定的基因片段和全基因組序列測定、分析等。構建基因組DNA文庫需考慮的問題代表性和隨機性代表性是指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。代表性是衡量文庫品質的一個很重要的指標。在文庫的構建過程中採用了兩個策略提高文庫的代表性：一、採用部分酶切或機械隨機切割的方法來消化DNA，以保證克隆的隨機性，保證每段DNA在文庫中出現的頻率均等；二、提高文庫所含基因組DNA的總容量，通常用覆蓋基因組的倍數來衡量。為預測一個完整基因組文庫應包含克隆的數目，Clark和Carbon於1975年提出如下的計算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一個完全基因組文庫所應該包含的重組克隆個數p：表示所期望的目的基因在文庫中出現的幾率f：表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值人的基因組為3×109bp，p=0.99，插入片段平均大小為1.7×104bp，則f=1.7×104/3×109；N=8.1×105即要有8.1×105個重組克隆才能包括99%的基因組例如：基因組DNA文庫的類型根據所選用的載體可以分為：噬菌體文庫質粒文庫柯斯（COS）質粒文庫細菌人工染色體