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基因工程细胞工程知识点汇总

??一、基因工程

（一）基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。

（二）基因工程的基本工具

1.限制性核酸内切酶（限制酶）

来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

切割结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。

2.DNA连接酶

作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

类型：根据来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T?DNA连接酶。E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能连接平末端；而T?DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端的效率比较低。

3.载体

作用：将外源基因送入受体细胞。

种类及特点

质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中；还有特殊的标记基因，如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等，便于重组DNA的鉴定和筛选。

λ噬菌体的衍生物：其基因组是双链DNA分子，它可以将自己的DNA整合到宿主细胞的染色体DNA中，从而实现基因的转移。

动植物病毒：如农杆菌中的Ti质粒、动物病毒等，它们可以感染动植物细胞，将携带的目的基因整合到宿主细胞的基因组中。

（三）基因工程的基本操作程序

1.目的基因的获取

从基因文库中获取：基因文库是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。基因组文库包含了一种生物的全部基因；cDNA文库是由mRNA反转录形成的DNA片段构建的，只含有该生物的部分基因。

利用PCR技术扩增目的基因

原理：DNA双链复制。

条件：模板DNA、引物、dNTP、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等。

过程：变性（9095℃，双链DNA解旋为单链）、复性（5560℃，引物与单链DNA结合）、延伸（7075℃，Taq酶从引物起始进行互补链的合成），一般通过多次循环可大量扩增目的基因。

人工合成：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

2.基因表达载体的构建

目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA；终止子位于基因的尾端，能够终止转录；标记基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

构建过程：用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端；用同种限制酶切割目的基因，产生相同的黏性末端；将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再用DNA连接酶将它们连接形成重组质粒。

3.将目的基因导入受体细胞

植物细胞

农杆菌转化法：农杆菌中的Ti质粒上的TDNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。将目的基因插入到Ti质粒的TDNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。

花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，从而导入受体细胞。

动物细胞

显微注射技术：将含有目的基因的表达载体提纯，用显微注射仪将目的基因注射到动物受精卵中，再将受精卵送入母体内，使其发育成具有新性状的动物。这是目前转基因动物中采用最多、最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。

微生物细胞：常用原核生物作为受体细胞，如大肠杆菌。其转化方法是：先用Ca2?处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

4.目的基因