基因功能研究技术.pptVIP

3、RNAi（RNAinterference,RNA干涉）RNAi技術利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內同源mRNA從而阻斷靶基因表達，使細胞出現靶基因缺失的表型。RNAi作用機制研究發現，雙鏈RNA是RNAi的觸發物，引發與之互補的單鏈RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。經過Dicer（一種具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工，細胞中較長的雙鏈RNA（30個核苷酸以上）首先被降解形成21～25個核苷酸的小分子干擾核糖核酸（siRNA，shortinterferingRNA），並有效地定位目標mRNA。由siRNA中的反義鏈參與指導合成被稱為RNA誘導的沉默複合體（RISC）的核蛋白體，再由RISC介導切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區域，從而實現干擾靶基因表達的功能。Phenotypiccharacterizationofbard1-31、酵母單雜系統（Yeastone-hybridsystem）研究DNA-蛋白質之間相互作用的新技術。在酵母細胞內研究真核生物中DNA-蛋白質之間的相互作用，並通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。三、蛋白質及DNA相互作用技術真核生物的轉錄起始，需要轉錄因數的參與。這些轉錄因數通常由一個DNA特異性結合功能域和一個啟動功能域組成，即DNA結合結構域(BD)和轉錄啟動結構域(AD)。用於酵母單雜交系統的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉錄因數。研究表明GAL4的BD可與酵母半乳糖苷酶的上游啟動位點結合，而轉錄啟動結構域與RNA聚合酶或轉錄因數TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄啟動結構域可完全獨立地發揮作用。原理：將順式作用元件與最基本啟動子（minimalpromoter，Pmin）相連並將報告基因連到Pmin下游，將待測轉錄因數cDNA與酵母轉錄啟動結構域（transcription-activatingdomain,AD）融合表達載體導入酵母細胞，該基因產物如果能夠與順式作用元件相結合，就啟動Pmin啟動子，報告基因表達。酵母單雜交的基本原理示意圖從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件結合的轉錄因數示意圖。2、凝膠滯緩實驗膠滯緩試驗（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA），是用於體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。是研究轉錄因數的經典方法。目前，該方法可用於檢測DNA結合蛋白、RNA結合蛋白，並可通過加入特異性的抗體（supershift）來檢測特定的蛋白質，並可進行未知蛋白的鑒定。原理：在凝膠電泳中，由於電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質相結合，那麼，由於分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內朝正電極移動的距離也就相應縮短了。TFsbindcis-elementwithobvioussequencespecificity.DRE:5’-ATACTACCGACAT-3’;DRE-2:5’-ATACTGCCGACAT-3’;mDRE:5’-ATACTACTTATAT-3’;mDRE-1:5’-ATACTTCCGACAT-3’;mDRE-2:5’-ATACTATCGACAT-3’;mDRE-3:5’-ATACTACTGACAT-3’;mDRE-4:5’-ATACTACCTACAT–3’mDRE-5:5’-ATACTACCGTCAT-3’;mDRE-6:5’-ATACTACCGATAT-3’GCC:5’-TAAGAGCCGCCACT-3’3.染色質免疫共沉澱技術（chromatinimmunoprecipitation，ChIP）用於研究活體細胞內染色質DNA與蛋白質相互作用。基本原理：在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA複合物，並將其隨機切斷為一定長度範圍內的染色質小片段，然後通過免疫學方法沉澱此複合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的資訊。（p226）1、酵母雙雜交系統鑒定新的蛋白與蛋白相互作用鑒定蛋白級聯底物鑒定突變對蛋白與蛋白結合的影響在已知的相互作用中鑒定干擾蛋白質(反向雙雜交系統)