PPP3CC对猪颗粒细胞增殖与凋亡的影响及其机制探究.pdf

摘要

哺乳动物绝大部分卵泡的发育都会走向闭锁，而出生后导致卵泡闭锁的始动因

素就是颗粒细胞的凋亡。研究发现，钙调神经磷酸酶的催化亚基PPP3CC在猪闭锁

卵泡颗粒细胞中显著下调，提示PPP3CC在卵泡闭锁过程中可能存在重要作用，但

其具体作用及机制尚未见报道。本论文以猪卵巢颗粒细胞系为研究对象，旨在探明

PPP3CC对颗粒细胞的作用，并探讨其可能的作用机制，从而丰富有关卵泡闭锁的

理论，并为提高家畜繁殖潜力提供新的思路。试验分为三部分：

1．PPP3CC在猪卵巢上的定位与表达规律。采用免疫组化和免疫荧光检测技术

研究PPP3CC在猪卵巢上的分布与表达规律，结果显示：PPP3CC在猪的不同大小和

发育阶段的卵泡上均有表达；RT-qPCR和WB结果显示，随着卵泡直径增大，

PPP3CC的表达量显著下调（P＜0.05），且在直径2~4mm健康卵泡中的表达量要

显著高于直径2~4mm的闭锁卵泡中的表达量（P＜0.05）；RT-qPCR结果显示，

PPP3CC在MⅡ期卵母细胞外的卵丘细胞中的表达量要显著高于GV期卵母细胞外

的卵丘细胞中的表达量（P＜0.05）。

2．PPP3CC对猪颗粒细胞增殖、凋亡、周期和类固醇激素分泌的影响。利用慢

病毒载体敲低PPP3CC在颗粒细胞中的表达，采用CCK-8法检测颗粒细胞活性，结

果显示，感染慢病毒96h后，PPP3CC敲低组的细胞活力显著低于对照组（NC），

但添加钙调神经磷酸酶激活剂（CHA）也可以显著降低细胞活力（P＜0.05）；细胞

计数法检测颗粒细胞增殖，结果显示在感染后72h时，敲低组的细胞数量显著低于

NC组（P＜0.05），但添加CHA也可以显著降低细胞数量（P＜0.05）；流式细胞术

检测细胞凋亡，结果显示，敲低PPP3CC可以显著增加猪卵巢颗粒细胞的凋亡和坏

死比例（P＜0.05），而添加CHA之后，猪卵巢颗粒细胞的凋亡比例显著降低（P＜

0.05）；流式细胞术检测细胞周期，结果显示，敲低组处于GOG1期、G2M期和S期

的细胞数量与NC组相比无显著差异（P＞0.05），添加激活剂组与敲低组相比，处

于GOG1期和G2M期的细胞数量无显著差异（P＞0.05），处于S期的细胞数量显

著升高（P＜0.05）；收集细胞培养液的上清，免疫化学发光法检测雌二醇（E）和

2

孕酮（P）的浓度，结果显示，各组敲低PPP3CC对E和P的浓度及其比E/P没

42424

有显著影响（P＞0.05），但利用shRNA-1712i敲低PPP3CC时，有促进P4分泌的

趋势，而添加CHA可以显著提升E2的浓度（P＜0.05）。

3．PPP3CC影响猪颗粒细胞增殖和凋亡的机制的初步研究。体外表达GST-

PPP3CC融合蛋白，对猪颗粒细胞裂解液进行Pull-down试验，质谱鉴定PPP3CC的

III

互作蛋白，共鉴定出328个蛋白，其中丰度最高的是SLC39A14。通过GO分析和

Pathway分析，这些蛋白主要参与MAPK信号通路（MAPKsignalingpathway）、

PI3K-Akt信号通路（PI3K-Aktsignalingpathway）。

结论：（1）PPP3CC在猪的不同大小和发育阶段的卵泡上均有表达；（2）

PPP3CC可促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，并抑制其凋亡和坏死；（3）初步筛选出

PPP3CC蛋白的互作蛋白SLC39A14，并筛选出PPP3CC发挥作用的PI3K-Akt信号

通路、MAPK信号通路。

关键词：猪；蛋白磷酸酶3催