蛋白质的分离纯化 (2).ppt

4、SDS—凝胶电泳：第93页，共132页，星期日，2025年，2月5日由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高盐溶第61页，共132页，星期日，2025年，2月5日盐析：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（saltingout）。第62页，共132页，星期日，2025年，2月5日大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。导致蛋白质表面的疏水基团的暴露盐析（（NH4）2SO4、Na2SO4）第63页，共132页，星期日，2025年，2月5日3．有机溶剂分级分离法与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。第64页，共132页，星期日，2025年，2月5日有机溶剂分级分离的机理有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。水是高介电常数物质(20℃时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20℃时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。第65页，共132页，星期日，2025年，2月5日4．温度对蛋白质溶解度的影响在一定温度范围内，约0～40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，在40～50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解能力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。第66页，共132页，星期日，2025年，2月5日三、根据电荷不同的纯化方法根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类一.电泳(electrophoresis)在外电场的作用下，带电颗粒，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质电泳分离原理：分子大小不同的蛋白质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移率不同，因此，在电泳时可以分开。第67页，共132页，星期日，2025年，2月5日1、电泳的类型目前电泳的类型很多，最常见的是区带电泳，由于在支持物上电泳时蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。第68页，共132页，星期日，2025年，2月5日区带电泳按其支持物的物理性状不同可以分成4类：①滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳)；②粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；第69页，共132页，星期日，2025年，2月5日③细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳；④凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高，-++—第70页，共132页，星期日，2025年，2月5日第71页，共132页，星期日，2025年，2月5日2、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamindegelelectrophoresis，简称PAGE)也称圆盘电泳，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,一般制作成凝胶柱或凝胶板，第72页，共132页，星期日，2025年，2月5日第73页，共132页，星期日，2025年，2月5日垂直板电泳的优越性：①表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰；②在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影；③胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，可用于制备；④胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描；⑤可进行双向电泳。第74页，共132页，星期日，2025年，2月5日按其凝胶的组成系统可分成四种：(1)连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的pH值和相同的缓冲液。(2)不连续凝胶电泳：采用二层或三层性质不同的凝胶(即：样品胶、浓缩胶和分离胶)重叠起来，使用两种不同的pH值（6.7和8.3）和不同的缓冲液（Tris-H