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MM_FS_CNG_0339食物氨基酸分光光度法

MM_FS_CNG_0339

食物中氨基酸的测定方法

1.适用范围

本方法适用于食物中的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十六种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。

本标准不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的氨基酸测定。

食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。

浓盐酸：优级纯；

6mol／L盐酸：浓盐酸（3.1）与水1∶1混合而成；

苯酚：须重蒸馏；

混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.00250mol／L；

缓冲液

pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH至2.2；

pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH至3.3；

pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH至4.0；

pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH至6.4；

茚三酮溶液

pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH·H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH至5.2；

茚三酮溶液：取150mL二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液50mL加入4g水合茚三酮（C9H4O3·H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6·2H2O）搅拌至完全溶解；

高纯氮气：纯度99.99％；

冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。

真空泵；

恒温干燥箱；

水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。用去离子水冲洗干净并烘干；

真空干燥器（温度可调节）；

氨基酸自动分析仪。

样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。

准确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品放于水解管中。

在水解管内加6mol／L盐酸10～15mL（视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。

打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50mL容量瓶内用去离子水定容。吸取滤液1mL于5mL容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2mL水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mLpH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。

准确吸取0.200mL混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5mL，此标准稀释液浓度为5.00nmol／50μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。

c×

1

×F×V×M

X＝

50

×100

m×109

式中：X——样品氨基酸含量，g／100g；

c——样品测定液中氨基酸含量，nmol／50μL；

F——样品稀释倍数；

V——水解后样品定容体积，mL；

M——氨基酸分子量；

m——样品质量，g；

1/50——折算成每毫升样品测定液的氨基酸含量，nmol／mL；

109——将样品含量由ng折算成g的系数。

注：①样品氨基酸含量在1.00g／100g以下，保留两位有效数字；含量在1.00g／100g以上，保留三位有效数字。

②十六种氨基酸分子量

天冬氨酸：133.1；

苏氨酸：119.1；

丝氨酸：105.1；

谷氨酸：147.1；

脯氨酸：115.1；

甘氨酸：75.1；

丙氨酸：89.1；

缬氨酸：117.2；

蛋氨酸：149.2；

异亮氨酸：131.2；

亮氨酸：131.2；

酪氨酸：181.2；

苯丙氨酸：165.2；

组氨酸：155.2；

赖氨酸：146.2；

精氨酸：174.2。

同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值≤12％。

9.1.测定条件