微生物基本操作规范.pptVIP

3.3.2稀释液的选择常用和特殊稀释液常用稀释液包括：0.85%生理盐水、缓冲蛋白胨水（BPW）、0.1%蛋白胨水、磷酸盐缓冲溶液、无菌蒸馏水等。特殊稀释液包括：D/E中和肉汤、LB肉汤、M肉汤等。最合适的稀释液应该通过一系列的试验得到，所选择的稀释液应该具有最高的复苏率。3.3.2.3嗜渗菌和嗜盐菌的稀释液20%的无菌蔗糖溶液适用于嗜渗菌计数；研究嗜盐菌时，可使用15%无菌的氯化钠溶液作为稀释液。3.3.2.2厌氧微生物的稀释液应使用具有抗氧化作用的培养基作为稀释液。制备样品悬液时应尽量避免氧气进入，使用袋式拍击式均质器。配备一些特殊的样品防护措施，如厌氧工作站等。常用取样工具包括：均质器及均质杯、拍击器及拍击袋、试管、刻度吸管、微量移液器、玻璃珠、检测天平、水浴锅、玻璃棒、酒精灯、镊子、刀子、电锯、托盘等。不同类型样品的取、制样制备液体样品稀释液时。用无菌移液管取10mL完全混匀的样品到带盖的无菌玻璃瓶中。加稀释液至100mL配成体积比为1：10的稀释液。也可选择质量体积比，取10g完全混匀的样品加入玻璃瓶，用无菌稀释液配制成100mL，制成质量体积比为1：10的稀释液。实际操作中，等效于1：10的质量比。按常规方法做进一步的稀释，整个样品稀释过程在30min内完成。液体样品3.3.3.2小颗粒固体样品面粉和奶粉等小颗粒固体样品的初识稀释液较容易配制。无菌称取10g样品加入到容积为100mL的无菌带盖玻璃瓶中，加入无菌稀释液至100mL刻度，配成质量体积比为1：10的稀释液。以30cm的幅度摇动25次。必要时按常规方法进一步稀释。对高溶解度样品计数时必须小心，计数结果取决于样品在稀释液中的均匀性，而均匀性又与样品的初识状态有关（常表述为个/g）。要得到准确的检测结果，第一个稀释液的体积是否准确达到100mL非常重要。除体积因素外，pH和水活度的变化也必须加以考虑。另外，稀释液中样品的转接应在30min内完成。3.3.3.3粉末状样品检测表层下面样品中的细菌时，应至少取10g样品加入适量的无菌稀释液，并在适当的设备中均质。常用的均质方法是使用拍击式均质器。将样品和稀释液一起放入无菌、耐用、薄而软的聚乙烯袋中，不接触均质器。均质时不会引起样品温度升高，较好地保护了待测样品。即使是冷冻样品，均质效果也很好。这种方法可用于制备浓度很低的稀释液。3.3.3.4表面样品表面样品取样后，先放到一定体积（如10mL）的稀释液中，妥善保存，使样品保持原始状态。检测时，用适当的稀释剂进行定量稀释（根据预测的污染程度稀释到所需稀释度）。检测后根据稀释的倍数进行换算。1接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。4接种、分离纯化接种工具图4-1接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀无菌操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。4.2接种法与纯培养的分离技术含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。平板划线分离培养法平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）。分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图4-2）图4-2平板划线分离法斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法1.曲线划线分离法先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物