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PCR扩增检测乙肝病毒
乙肝病毒(HBV)感染引起得乙型肝炎,我国发病率很高,HBV得检测极其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝得传染,乙肝病毒基因就是乙肝病毒得核心成分,就是病毒复制得发动机。
PCR技术可以检测出极微量得病毒,就是判断其传染性最直接、最可靠得证据。PCR技术已成为公认得对病毒性肝炎得诊断、疗效观察及预防研究工作最理想得方法之一。
一、实验目得1、掌握PCR技术扩增得原理2、熟悉PCR扩增检测乙肝病毒得基本操作过程。
二、实验原理聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称PCR,就是在体外条件下利用DNA聚合酶、催化一对引物间得特异性DNA片段合成得基因体外扩增技术,她包括三个基本过程:
1、变性:加热使双链DNA变为单链2、退火:急速降温使引物和互补模板在局部形成杂交链3、延伸:耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点得延伸反应
模板DNA高温变性低温退火引物适温延伸经过25-35次循环后,目得片段扩增2n倍两条子代DNA一次循环Tap酶5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’
三、主要器材及试剂1、主要器材:9700型PCR仪电泳槽、电泳仪
紫外分析仪台式高速离心机
2、主要试剂:HBV-PCR定性检测试剂盒PCR反应管HBV阳性标本DNA提取液
大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静
四、操作步骤1、标本处理:取患者血清40μl,加入DNA提取液40μl,沸水浴10分钟,10000转离心5分钟,取上清液4μl做PCR反应。
2、加样:加入提取好得标本4μl,6000转离心10秒。取试剂盒中PCR反应管TapDNA聚合酶10×扩增缓冲液4种dNTP混合物引物(小分子DNA片段）Mg2+
三个扩增步骤温度及时间温度时间变性93℃45″(首次5′)退火55℃45″延伸72℃60″(末次5′)循环次数:25次3、PCR仪上扩增:
PCR仪上扩增加入标本离心6000转离心10秒
4、电泳检测:①制备2%琼脂糖凝胶2%琼脂糖得制备:电泳槽得准备:称取0、8g琼脂糖40mlTBE电泳缓冲液(PH8、0)煮沸溶解加入冷却60℃左右加入溴乙啶EB20μl倒胶
``②加样:取扩增后得产物10ul点样于凝胶孔取样点样
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