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ATP含量测定试剂盒简化说明书
一、所需仪器
可见分光光度计、恒温水浴锅、漩涡混匀器
样本前处理:
○红细胞:抗凝全血取下层压积红细胞,一般按1:4的体积比加双蒸水进行稀释,再混匀
使溶血完全,制备成溶血液。将制好的溶血液加入玻璃试管中沸水加热煮10分
钟,流水冷却后,4000转离心10分钟,取出混匀抽提1分钟,取上清液待测。
○组织样本:称重后,剪碎,按重量体积比(W/V)1:9加入沸双蒸水,在沸水中匀浆,制
成10%的匀浆液,再置于沸水浴中煮10分钟,取出混匀抽提1分钟,4000转/
分离心10分钟,取上清液待测。
○培养细胞:先离心处理将细胞核培养上清分离,除去培养上清,得到下层沉淀细胞(一般
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细胞数量达到10),将收集好的细胞加入300-500μl热双蒸水,置于热水浴
(90-100℃)中匀浆破碎,后将细胞悬液于沸水浴中加热10分钟,取出混匀
抽提1分钟,即可用于测定。
注:混匀抽提1分钟即为漩涡混匀1分钟。
二、操作步骤:
管别(ul)
标准管S标准空白管S测定管U对照管U
反应体系BB
蒸馏水1010
50μmol/LATP标准液3030
样本3030
试剂一:底物液Ⅰ100100100100
试剂二:底物液Ⅱ50505050
试剂三:促进剂3030
旋涡混匀,37°C水浴30分钟
试剂四:蛋白沉淀剂50505050
充分混匀后,4000rmp/min离心5分钟,取上清液210ul进行测定
试剂五:显色液500500500500
混匀,室温静置2分钟
试剂六:终止剂500500500500
室温静置5分钟,在636nm处0.5cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度值。
注:在比色前比色皿用自来水洗10余次,再用蒸馏水洗4~5次,以免磷污染。
五、计算公式及举例:
①红细胞中ATP含量计算公式:
ATP浓度测定管−对照管
=×标准浓度×样本测定前稀释倍数÷血红蛋白含量(Hbg/L)
(/)标准管−标准空白管
mmolgHb
UU
−
=B×0.05×mmol/L×样本测定前稀释倍数÷血红蛋白含量(Hbg/L)
SS
−
B
②组织中ATP
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