植物细胞培养的基本过程和方法.pptVIP

第十章

植物细胞培养的基本过程和方法第一节植物细胞的获取细胞来源：1、外植体；2、愈伤组织一、从外植体直接分离植物细胞外植体的选择：适当生长期的健康植株、细胞之间粘连程度小；叶片组织外植体的前处理：冲刷材料;流水几分钟-数小时吐温表面浸润灭菌；超净台70%酒精10-30S深层灭菌；氯化汞次氯酸钠无菌水冲洗。3min/次3-10次愈伤组织的概念--P173形成过程：起始期；（诱导期）准备进行分裂分裂期；细胞体积变小→分生状态形成期。大小稳定内部深层细胞开始分裂二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞怎样从愈伤组织分离得到细胞？01P175获得愈伤组织后，挑选质量好的愈伤组织块，用无菌的镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养基中，加入经过灭菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。果胶酶增强分散效果02第二节悬浮培养（cellsuspensionculture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。1、悬浮细胞的诱导---愈伤组织诱导要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。适于悬浮培养适于再生植株如何获得符合要求的愈伤组织？选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。选择适宜的培养基：生长素浓度很重要配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性好、细胞状态好的细胞不断继代培养。悬浮细胞生长动态：基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一定容积的培养液中进行，在一个培养周期不添加培养基。这种培养体系基本是处于封闭状态。当一种营养物质耗尽时，细胞即停止生长。在这种悬浮培养体系中，细胞扩增生长成S形曲线。细胞生长计量:细胞计数细胞密实体积细胞鲜重细胞干重细胞活力测定细胞生长指标细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。0102悬浮细胞培养的同步化体积选择法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。01饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。02低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。抑制法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。01方法：吸附法、包埋法02第三节固定化培养12包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；吸附式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。12第四节单细胞培养悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。平板培养1看护培养2微室培养3条件培养（双层滤纸培养）41平板培养(plateculture)：将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。2单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。3单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5×105／ml。4植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约1~2mm。5封口：用石蜡膜封培养皿。1、细胞平板培养2、看护培养看护培养（nurseculture）：是由Muir1954年设计的。1操作方法：2在固体培养基上置入一块3活跃生长的愈组织，再在愈4伤组织上放一小片滤纸，待5滤纸湿润后将细胞接种于滤6纸上。当培养细胞长出微小7细胞团以后，将其直接转至8琼脂培养基上让其迅速生长9微室培养01它可对单细胞进行活体连续观察。这一