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B40

DB1302

唐山市地方标准

DB1302/T397—2014

动物产品中动物源性成分检测方法实时荧光PCR法

2014-11-25发布2014-12-25实施

唐山市质量技术监督局发布

DB1302/T397—2014

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由唐山市质量技术监督局提出。

本标准由唐山市农牧局归口。

本标准起草单位：唐山市畜牧水产品质量监测中心。

本标准起草人：张建民、张鑫、李爱军、蒙君丽、张雅会、庞学良、周鑫、肖琎、张鹤鹏、赵福国。

DB1302/T397—2014

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动物产品中动物源性成分检测方法实时荧光PCR法

1范围

本标准规定了动物产品中动物（猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉）源性成分检测实时荧光PCR法。

本标准适用于动物产品中动物（猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉）源性成分定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义、缩略语

下列术语和定义、缩略语适用于本文件。

3.1术语和定义

3.1.1Ct值

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

3.1.2TaqMan探针

寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭剂连接在探针的3’末端。

3.1.3猪源性成分

猪种属特异性DNA片段。

3.1.4牛源性成分

牛种属特异性DNA片段。

3.1.5羊源性成分

羊种属特异性DNA片段。

3.1.6兔源性成分

兔种属特异性DNA片段。

3.1.7马源性成分

马种属特异性DNA片段。

3.1.8驴源性成分

驴种属特异性DNA片段。

3.1.9鸡源性成分

鸡种属特异性DNA片段。

3.1.10鸭源性成分

鸭种属特异性DNA片段。

3.1.11鹅源性成分

鹅种属特异性DNA片段。

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3.1.12狗源性成分

狗种属特异性DNA片段。

3.1.13猫源性成分

猫种属特异性DNA片段。

3.1.14鼠源性成分

鼠种属特异性DNA片段。

3.1.15貉源性成分

貉种属特异性DNA片段。

3.2缩略语

DNA：脱氧核糖核甘酸

PCR：聚合酶链式反应

4原理

利用TaqMan探针实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对不同动物源性成分进行鉴定。利用裂解液裂解细胞释放DNA，再结合DNA制备膜技术提取DNA。以提取的DNA为模板，通过特异性引物和荧光物质探针进行动物源性成分实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对动物产品中动物源性成分的定性分析。

5材料与试剂

5.1设备和材料

5.1.1实时荧光PCR检测系统

5.1.2高速台式冷冻离心机（最高转速12000r/min以上）

5.1.3剪刀、镊子（经180℃±2℃,2h高温灭菌）

5.1.4微量可调移液器及配套吸头（10μL、200μL、1000μL）

5.1.5实时荧光PCR反应管

5.1.6离心管（1.5mL、2.0mL）

5.1.7紫外灯

5.1.8水浴锅

5.1.9恒温干燥箱

5.1.10超纯水机

5.1.11分析天平：感量为0.00001g

5.2试剂

除特别说明以外试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

5.2.1无水乙醇（C2H6O）：优级纯

5.2.2基因组DNA提取试剂盒

本试剂盒分试剂PartⅠ和PartⅡ两部分。详见表1，表2。

DB1302/T397—2014

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表1PartⅠ组成

蛋白酶K（ProteinaseK，20mg/mL）1mL

核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL）0.5mL

注：-20℃保存

表2PartⅡ组成

缓冲液GL（BufferGL）12mL

缓冲液GB（BufferGB）