《分子生物学技术》课件.pptVIP

*************************************限制性内切酶23作用机制识别特定DNA序列并在特定位点切割双链DNA，产生平末端或粘性末端I型：复杂结构，切割位点不确定II型：最常用，识别和切割位点一致或邻近III型：需要两个识别位点，切割位置固定识别特点通常识别4-8bp的特定序列，多为回文结构4bp识别位点：如HaeIII(GGCC)6bp识别位点：如EcoRI(GAATTC)8bp识别位点：如NotI(GCGGCCGC)反应条件每种酶有特定的反应条件要求温度：通常37℃，部分需要其他温度缓冲液：离子强度、pH值辅助因子：通常需要Mg2?应用领域分子克隆的核心工具基因工程：构建重组DNA分子基因组分析：限制性片段长度多态性基因诊断：限制性片段长度多态性分析载体的类型与选择质粒载体最常用的克隆载体，通常为环状双链DNA，大小2-10kb。具有自主复制起点、抗性标记、多克隆位点等基本元件。适合克隆小于10kb的DNA片段，复制数量高，易于提取和操作。典型代表有pUC、pBR322和pBluescript系列。噬菌体载体基于噬菌体基因组改造的载体，如λ噬菌体和M13噬菌体。λ载体可容纳约15-20kb的外源DNA，适合构建基因组文库。M13载体产生单链DNA，特别适合于DNA测序和定点突变。噬菌体感染效率高，便于大规模筛选。人工染色体用于克隆大片段DNA的载体系统，包括酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和P1人工染色体(PAC)。YAC可容纳100-2000kb的DNA片段，但不稳定；BAC较为稳定，可容纳100-300kb的DNA；PAC兼具两者优点。这些载体是全基因组测序项目的重要工具。连接酶与连接反应连接酶种类分子克隆常用T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可连接平末端和粘性末端；大肠杆菌DNA连接酶仅能连接粘性末端。T4酶需要ATP作为能源，而大肠杆菌酶利用NAD+反应机制连接酶催化DNA片段间相邻核苷酸的5-磷酸基团与3-羟基之间形成磷酸二酯键，修复DNA链中的缺口。是ATP依赖的三步反应过程，形成酶-AMP中间体3反应条件优化温度影响连接效率，粘性末端通常16℃反应，平末端则4℃反应效果更好。载体与插入片段的摩尔比例通常为1:3至1:5。反应时间从1小时至过夜不等连接产物处理连接产物可直接用于转化或储存于-20℃。反应前可热灭活连接酶，部分转化方法需要脱盐处理。连接效率可通过转化效率或连接产物的PCR验证评估转化与筛选转化方法化学转化法：氯化钙处理使细胞壁变得通透，热激促使DNA进入细胞电转化法：电脉冲暂时性形成膜孔，使DNA进入细胞，效率高但设备要求高生物转化法：利用细菌的自然转化能力，适用于某些特定菌种感受态细胞经过特殊处理能够接受外源DNA的细胞，通常通过以下方法制备：氯化钙法：冰浴条件下用CaCl?处理细胞TSS法：以PEG、DMSO和二价阳离子处理细胞超高效感受态细胞：商业化制备，转化效率高筛选方法克隆筛选的常用策略：抗性筛选：利用载体上的抗性标记基因蓝白斑筛选：基于β-半乳糖苷酶基因的插入失活PCR筛选：使用特异性引物验证插入片段限制性酶切分析：确认插入片段的大小和方向转化是将外源DNA导入宿主细胞的过程，是基因克隆的关键步骤。成功的转化取决于多种因素，包括DNA纯度、感受态细胞质量、热激温度和时间等。筛选是从大量转化细胞中鉴定含有目标重组质粒的克隆的过程，通常结合多种方法以提高筛选效率和准确性。初筛通常采用抗性和蓝白斑筛选，复筛则使用PCR和酶切分析等分子方法。重组DNA的检测方法限制性酶切分析利用限制性内切酶切割质粒，通过凝胶电泳分析片段大小模式，验证插入片段的存在、大小和方向。根据质粒图谱选择合适的酶，切割后的特征性条带模式可确认克隆正确性。PCR验证设计针对插入片段或跨接载体-插入片段连接处的引物，通过PCR扩增特异性片段。PCR方法快速、灵敏，可检测小量样品，适合高通量筛选，但需要已知序列信息设计引物。南方杂交将DNA转移至膜上，用标记的探针进行杂交检测，具有高特异性。适合检测复杂基因组中的特定序列，或验证基因组整合事件，但操作复杂且耗时较长。DNA测序直接测定克隆DNA的核苷酸序列，是最准确的验证方法。可全面确认插入片段的序列、方向和突变情况，尤其适用于需要精确序列信息的实验。随着技术进步，成本降低使其成为常规验证手段。基因文库构建基因组DNA准备提取高分子量基因组DNA，确保完整性和纯度，避免降解和污染DNA片段化使用机械剪切(超声