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家禽细胞免疫应答评估方法的操作规范

1范围

本文件规定了家禽的外周血单个核细胞及脾脏单个核细胞分离技术、细胞表面标志物检测、体外培养家禽T细胞技术、IFN-γELISpot检测法、IFN-γICS检测法、细胞因子转录水平实时荧光RT-PCR检测法以及细胞因子蛋白水平ELISA检测法。

本文件适用于病原微生物抗原刺激下家禽的细胞免疫应答评估研究。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

GB/T24863-2010畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程

ISO14698-1生物污染控制规范性指南

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1T细胞

一种来源于胸腺的淋巴细胞，在细胞免疫中发挥核心作用，分为CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞等亚群。

3.2CD4+T细胞

又称辅助性T细胞，表面带有CD3和CD4受体，通过释放多种细胞因子调节免疫反应。

3.3CD8+T细胞

又称细胞毒性T细胞，表面带有CD3和CD8受体，主要通过识别和杀伤病原体感染细胞，发挥免疫效应。

3.4CD4+CD8+T细胞

双阳性T细胞，表面带有CD3、CD4和CD8受体，在家禽外周血中的含量较多，在脾脏和肠道中也有分布。

3.5免疫相关基因

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在宿主免疫反应中起关键作用的基因。如下所示：

细胞毒性相关基因：GranzymeA、GranzymeK、Perforin、IL-2、IFN-γ、TNF-α、NKlysin、PARP等。

抗病毒相关基因：IFN-α、IFN-β、MX1、OASL、MDA5，ISG12-2、IFIT5等。

Th2细胞因子：IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等。

趋化因子：CXCLi1、CXCLi2等。

模式识别受体：TLR-3、TLR-7等。

炎性因子：IL-1β、IL-6等。

免疫调节因子：TGF-β3、IL-10等。

4缩略语

AIV：禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus）

APC：抗原递呈细胞（Antigen-presentingCells）

CXCLi1：CXC基序趋化因子配体1（C-X-CMotifChemokineLigand1）

CXCLi2：CXC基序趋化因子配体2（C-X-CMotifChemokineLigand2）

FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）

GranzymeA：颗粒酶A（GranzymeA）

GranzymeK：颗粒酶K（GranzymeK）

IL-1β：白细胞介素-1β（Interleukin-1Beta）

IL-2：白细胞介素-2（Interleukin-2）

IL-4：白细胞介素-4（Interleukin-4）

IL-5：白细胞介素-5（Interleukin-5）

IL-6：白细胞介素-6（Interleukin-6）

IL-10：白细胞介素-10（Interleukin-10）

IL-13：白细胞介素-13（Interleukin-13）

IFIT5：干扰素诱导蛋白5（Interferon-induceproteinwithtetratricopeptiderepeats5）

IFN-α：干扰素-α（Interferon-Alpha）

IFN-β：干扰素-β（Interferon-Beta）

IFN-γ：干扰素-γ（Interferon-Gamma）

ISG12-2：干扰素刺激基因12-2（Interferon-stimulatedgene12-2）

MX1：抗黏病毒蛋白1（MyxovirusResistanceProtein1）

MDA5：黑色素瘤分化相关基因5（Melanomadifferentiation-associatedgene5）

MOI：感染复数（MultiplicityofInfection）

NKlysin：自然杀伤细胞溶素基因（NKlysin）

OASL：2-5-寡聚腺苷酸合成酶样蛋白（2-5-OligoadenylateSynthetase-LikeProtein）

PARP：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly(ADP-Ribose)Polymerase）

PBMCs：外周血单个核细胞（PeripheralBloodMonon