水解酶及氧化还原酶组织化学原理及方法.ppt

应用此酶定位于溶酶体、内质网，在肝、肾、胰和小肠酶活性高单核巨噬细胞含酶最丰富T淋巴细胞局限性点状阳性，B淋巴细胞阴性用作髓性白血病的鉴别诊断：非特异性酯酶氟化钠处理后原粒细胞性＋＋原单核细胞性＋－第30页，共45页，星期日，2025年，2月5日胆碱酯酶乙酰胆碱脂酶(acetycholinesterase，AchE)水解乙酰胆碱分布于神经元胞质内、神经与肌肉接头处（运动终板）、红细胞等，酶的检测用于追踪神经通路。最适pH7.5~8.0胆碱脂酶(cholinesterase，ChE)水解胆碱的酯见于血清、胰、唾液腺内最适pH8.0~8.5第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日抑制剂毒扁豆碱，DFP（二异丙基氟磷酸）抑制AchE和ChE四异丙基焦磷酸酰胺特异性抑制ChEBW284C51特异性抑制AchE第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日方法：亚铁氰化铜法染色原理作用液碘化乙酰硫代胆碱（底物）5.0mg0.1M顺丁烯二酸缓冲液（pH6）6.5ml0.1M柠檬酸钠0.5ml5M铁氰化钾1.0ml30mM(0.75%)CuSO4（捕捉剂）1.0ml蒸馏水（或抑制剂）1.0ml作用条件温度37℃或室温；时间30～60min用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤。第33页，共45页，星期日，2025年，2月5日氧化还原酶

oxidoreductases细胞的氧化还原反应主要是由氧化还原酶或脱氢酶催化的氧化还原反应是由氢的供体把氢原子转移到氢的受体的酶促反应，即脱氢酶反应第34页，共45页，星期日，2025年，2月5日脱氢酶脱氢酶是氧化底物，从底物将氢传递给受氢体的酶系。不同于氧化酶，合适的受氢体不是大气中的氧，而是辅酶I、辅酶II（NDAP）或黄素蛋白，然后经氢传递系统，使受氢体还原显色，从而达到定位目的。组化示脱氢酶分不需辅酶和必需辅酶二种。脱氢酶的组化方法，以四唑盐和铁氰化物为受氢体第35页，共45页，星期日，2025年，2月5日四唑盐法的基本原理受氢体第36页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日水解酶

hydrolases指催化底物发生水解反应的酶类例如:磷酸酶类、酯酶类等AB＋H2OAH＋BOH酶第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日磷酸酶类磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称水解磷酸酯键，释放磷酸离子，为重金属捕获而产生沉淀；或释放萘酚而为重氮盐耦联而显色。碱性磷酸酶：在pH9.2-9.4表现为最大活性酸性磷酸酶：在pH5.0显示最大活性显示法：金属沉淀法偶氮耦联法第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日碱性磷酸酶

alkalinephosphatase,AKP、ALP在碱性范围，催化各种醇和酚的磷酸酯水解。磷酸和R能用组化方法捕获。钙钴法：捕获磷酸偶氮耦联法：当R为萘酚衍生物时，捕获R二者最终均形成有色沉淀，可作定位观察。第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日激活：金属离子—Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+抑制：Tetramisol(四咪唑)、各种醇类、L-半胱氨酸第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日钙钴法（金属沉淀技术）

Gomori-Takamatus法原理：把游离的磷酸变为盐的形式从而产生沉淀β-甘油磷酸钠（底物）─→磷酸离子磷酸离子+Ca2+─→磷酸钙（不可见）磷酸钙+Co2+─→磷酸钴（不可见）磷酸钴+S2-─→硫化钴（不溶，可见）条件：pH9.4AKP第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日作用液：2%巴比妥钠3%β-甘油磷酸钠2%无水氯化钙2%MgSO4.7H2O第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日步骤：新鲜恒冷箱切片，8μ不固定直接进作用液FCa（氯化钙Formalin）固定5-2h，4℃，固定后蒸馏水洗作用液10-60’，37℃（视组织而定）流水5’2%硝酸钴5’蒸馏水洗1-2%硫化铵1’（*硫化铵需新鲜配制）蒸馏水洗甘油明胶封第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日结果：黑色的颗粒状沉淀对照：去底物（以双蒸水替代β-甘油磷酸钠），结果阴性进作用液前用抑制剂抑制酶或将切片置沸水中使酶失活注意：组织内含铁血黄素与钙盐形成棕黑色沉淀，应鉴别（铁反应）第9页，共45页，星期日，2025年，2月5日AKP主要存在于