《基因重组》课件.pptVIP

*************************************PCR技术与基因重组聚合酶链反应（PCR）技术自1983年由KaryMullis发明以来，已成为分子生物学中最重要的技术之一。它通过体外酶促反应实现特定DNA片段的指数级扩增，为基因重组提供了强大的工具。在基因重组中，PCR不仅用于扩增目标DNA片段，还可以通过引物设计引入限制酶位点、启动子序列或标签序列等功能元件。PCR在基因重组中的应用还包括重叠延伸PCR（用于基因融合和定点突变）、反向PCR（用于未知序列克隆）、实时定量PCR（用于基因表达分析）等变种技术。随着高保真DNA聚合酶的开发和PCR仪器的改进，现代PCR技术已能实现长达数十kb的DNA片段扩增，且错误率极低，极大地扩展了基因重组的可能性。同源重组技术基因靶向利用细胞内同源重组机制，使外源DNA整合到基因组特定位置，实现基因精确修改。这一技术最初在酵母中发展，后来扩展到哺乳动物细胞，成为创建基因敲除和敲入小鼠的基础。重组工程在细菌中利用噬菌体重组蛋白（如λRed系统）介导的同源重组，修改大片段DNA如BAC。这一技术大大简化了复杂DNA结构的工程化过程，特别适用于基因组操作。酵母同源重组克隆利用酵母细胞高效的同源重组能力，将多个DNA片段在体内一步组装。这一方法克服了传统限制酶-连接酶克隆的限制，是合成生物学中构建大片段DNA的重要工具。基因打靶技术1载体构建含靶基因同源序列和选择标记2干细胞转染将载体导入胚胎干细胞3细胞筛选富集发生重组的细胞4嵌合体小鼠生成将修饰干细胞注入胚胎5后代筛选获得同基因型突变个体基因打靶（GeneTargeting）是一种利用同源重组原理，精确修改特定基因的技术。它最初由MarioCapecchi、MartinEvans和OliverSmithies开发，他们因此共享2007年诺贝尔生理学或医学奖。这项技术最广泛的应用是在小鼠中创建基因敲除（Knockout）和基因敲入（Knock-in）模型。尽管基因打靶技术极为强大，但其主要限制在于效率低下（通常为10^-6至10^-7）和操作耗时（从设计到获得纯合突变小鼠通常需要一年以上）。近年来，随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的出现，基因打靶的效率和速度得到了极大提升，但传统基因打靶技术凭借其精确性和可靠性，在某些应用中仍然不可替代。CRISPR/Cas9基因编辑技术设计指导RNA针对目标基因位点设计sgRNA1形成RNA-蛋白复合物sgRNA与Cas9核酸酶结合2识别目标序列复合物结合互补目标DNA3切割DNACas9在特定位点切割双链4DNA修复通过NHEJ或HDR修复断裂5CRISPR/Cas9系统源自细菌的获得性免疫系统，由JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier等人开发为基因编辑工具，他们因此获得2020年诺贝尔化学奖。相比传统基因编辑技术，CRISPR/Cas9具有设计简单、效率高、成本低和能同时编辑多个位点等优势。CRISPR技术已在基础研究、医学和农业等领域取得广泛应用。在基础研究中，它用于基因功能研究和疾病模型构建；在医学上，已开始用于治疗β-地中海贫血和癌症等疾病；在农业中，则用于培育抗病、高产作物。该技术的不断优化和改进，如开发高特异性变体、精确碱基编辑器等，正推动我们进入精准基因组编辑的新时代。基因重组在医学中的应用1基因治疗利用基因重组技术将功能基因导入患者体内，修复或替代缺陷基因，从根本上治疗遗传性疾病。如腺相关病毒载体携带RPE65基因治疗先天性黑蒙症，已获FDA批准。2生物制药通过重组DNA技术在微生物或哺乳动物细胞中生产人类蛋白质药物，如胰岛素、生长激素、干扰素、抗体药物等。这些药物具有高特异性和低毒性，已成为现代医药的重要组成部分。3分子诊断基于PCR、DNA测序和基因芯片等重组DNA技术的分子诊断方法，能够快速、准确地检测遗传疾病、传染病病原体和肿瘤标志物，为精准医疗提供支持。4疫苗开发重组疫苗通过基因工程技术生产病原体的抗原蛋白或将抗原基因整合入载体中，具有安全性高、特异性强的优点。如乙肝疫苗和HPV疫苗均为重组疫苗。基因治疗1体细胞基因治疗修改患者的体细胞（非生殖细胞），治疗效果仅限于个体而不会遗传给后代。目前绝大多数基因治疗临床试验和已批准产品都属于这一类型，如用于治疗遗传性失明的Luxturna。2体内基因治疗将治疗性基因直接导入患者体内的靶组织细胞。这种方法操作相对简单，但面临基因递送效率、靶向性和免疫反应等挑战。