《基因鼠的奥秘》课件.pptVIP

*************************************基因编辑技术的局限性脱靶效应CRISPR-Cas9系统可能在非预期位点引起DNA切割，导致脱靶突变。这些非特异性编辑可能引入未检测到的基因组变异，干扰实验结果解释或引发安全性问题。编辑效率限制基因编辑效率受多种因素影响，包括递送方法、细胞类型和靶序列特性。特别是HDR介导的精确编辑和大片段插入，效率通常较低，增加了筛选难度和成本。DNA损伤响应基因编辑引起的DNA双链断裂可能激活细胞DNA损伤响应，导致细胞周期停滞或细胞死亡。在某些敏感细胞中，这可能限制基因编辑应用或引入选择压力。嵌合现象在胚胎发育早期进行基因编辑可能导致嵌合体形成，即动物体内存在基因型不同的细胞群体。这增加了表型分析和繁育纯合突变小鼠的复杂性。技术局限性与应用挑战并存，PAM序列依赖性限制了可编辑位点选择，特别是对于传统SpCas9，其需要NGGPAM序列。此外，某些基因组区域（如高度重复序列和异染色质区域）难以有效编辑，而大片段基因组修饰（如大片段敲入或复杂重排）的效率仍然较低。脱靶效应及其解决策略脱靶识别方法生物信息学预测：使用算法预测潜在脱靶位点GUIDE-seq：通过DNA双链断裂捕获识别全基因组脱靶位点Digenome-seq：体外消化的基因组测序CIRCLE-seq：循环DNA富集与测序全基因组测序：直接检测所有潜在变异减少脱靶的策略优化gRNA设计：避免与基因组其他区域高度同源的序列使用高特异性Cas9变体：如eSpCas9、SpCas9-HF1切口Cas9(nCas9)：仅切割一条DNA链，减少脱靶风险控制Cas9暴露时间：使用可降解的Cas9蛋白碱基编辑器或质粒编辑器：避免DNA双链断裂验证与质控在基因编辑鼠模型开发中，脱靶效应验证是质量控制的重要环节。通常采用测序预测脱靶位点、繁育策略分离脱靶突变和与野生型对照比较分析等方法，确保表型变化确实源于目标基因修饰而非脱靶效应。脱靶效应是基因编辑技术面临的主要挑战之一，其发生率取决于多种因素，包括gRNA设计、Cas9蛋白变体、递送方法和细胞类型。尽管在小鼠模型构建中，通过繁育可以逐渐消除非连锁脱靶突变，但关键基因组区域的脱靶效应仍可能干扰实验结果和解释。基因编辑效率的优化方法1gRNA设计优化选择高活性靶点和优化序列特征递送系统改进优化递送载体和方法3Cas9蛋白工程开发高活性Cas9变体化学修饰RNA和蛋白质化学修饰提高稳定性基因编辑效率优化是提高基因编辑鼠模型构建成功率的关键。在gRNA设计方面，研究表明靶序列的核苷酸组成（特别是PAM附近区域）、潜在二级结构和染色质可及性都会影响编辑效率。多种生物信息学工具已开发用于预测gRNA活性，如Azimuth和DeepCpf1等。递送方式选择也显著影响编辑效率。对于基因编辑鼠，RNP复合物（预先组装的Cas9蛋白与gRNA）通常比质粒递送提供更高效率和更低毒性。电穿孔技术作为显微注射的替代方法，允许同时处理多个胚胎，提高操作效率。此外，小分子化合物如SCR7（DNA连接酶IV抑制剂）和RS-1（RAD51激活剂）等可分别抑制NHEJ或促进HDR，从而增强特定编辑途径的效率。近期研究还发现细胞周期调控和低温处理可提高HDR效率。新型Cas蛋白的开发与应用Cas蛋白类型特点优势应用领域SpCas9变体高保真/高特异性降低脱靶效应精确基因编辑SaCas9/St1Cas9体积小型化递送效率提高体内基因治疗Cas12a(Cpf1)T-richPAM需求拓展靶点范围AT富集区域编辑碱基编辑器无DNA双链断裂精确点突变引入遗传病模型构建质粒编辑器特定转氨酶活性精确CG转换点突变疾病研究新型Cas蛋白不断丰富基因编辑工具箱，扩展了基因编辑的可能性。Cas12a(Cpf1)与SpCas9相比，具有不同的PAM识别需求（TTTV而非NGG），自身加工crRNA的能力，以及产生粘性末端而非平末端的切割模式，为某些应用提供了互补选择。碱基编辑器（BE）和质粒编辑器（PE）是无需DNA双链断裂的精确点突变技术，前者将特定碱基转换系统（如脱氨酶）与催化失活的Cas9(dCas9)融合，实现CT或AG转换；后者利用逆转录酶活性实现更广泛的碱基替换。这些技术在构建点突变疾病模型中具有特殊优势，避免了传统HDR途径效率低的问题。此外，RNA编辑系统如REPAIR（Cas13与ADAR融合）允许在不改变基因组的情况下修改RNA转录本，为研究基因表达调控提供了新工具。基因编辑鼠的福利与伦理考虑基因编辑