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细胞培养操作规范

细胞培养的基本条件

1.无菌环境:

细胞培养间消毒

a:使用前紫外照射20-30分钟

b:使用完75%酒精擦拭台面,紫外照射15

分钟

C:每两周用84消毒液擦拭地面、台面一次的

方式进行消毒

超净工作台

使用前

开启柜内紫外灯照射15-30分钟

使用时

开启鼓风,在台面内操作

使用完毕后

要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净,紫

外照射10分钟。

co2培养箱:

1设定的条件为37℃,5%C02。

2使用CO2培养箱应注意的问题

用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证

通

保持培养箱内空气干净,定期消毒擦拭。

箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000毫升

,以保持箱内湿度。

控制水盘内污染的方法

1、定期(至少每两周一次),更换水盘内的无菌

蒸馏水或无菌去离子水。

2、在水盘内添加适量硫酸铜,预防真菌污染。

配制方法:20g无水硫酸铜+5ml浓硫酸+1L

灭菌纯水。

3、水盘内添加适量抗生素。

4、定期为培养箱(含水盘)进行一次高温灭菌

2.细胞培养条件

细胞培养器皿:

细胞培养瓶:

25平方厘米(加液量3-5m|)

75平方厘米(加液量10-15m

150平方厘米(加液量40m)

细胞培养板:

培养器皿底面积加培养液量可获细胞量

96孔培养板032

0.1

105

4孔培养板2

1.O

5×105

12孔培养板4.5

2.0

10

6孔培养板9.62.52.5×106

细胞培养皿

35mm(加液量3m)

a60mm(加液量5m)

100mm(加液量10m|)

150mm(加液量15m)

■常用培养基:

RPMI1640:

适合许多种细胞,如肿瘤细胞、正常细胞的原代培

养、传代培养等。

尤其适合人白细胞,如H9、HL-60、IM-9和K

562等细胞系的培养

DMEM:

DMEM(A)【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】

DMEM(H)【含谷氨酰胺、高糖型(4500mg/L

)、除菌过滤灭菌】

DMEM(L)【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/L)

除菌过滤灭菌】

■血清:

常用血清种类:胎牛血清、新生牛血清、小牛血

血清的灭活(消除补体活性)56℃,30分钟。

使用浓度:5%-20%,一般10%

血清的消毒:过滤除菌

血清解冻步骤:-20℃或-70℃至4℃冰箱溶解

天,至室温下全溶后再分装,一般用15m无菌

离心管分装。

谷氨酰胺:

谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃C放置1周可分

解50%,故应单独配制,置于-20℃保存,临

用前加入培养液