《病原与免疫血清制备》课件.pptVIP

*************************************蛋白质抗原的制备重组蛋白表达重组蛋白表达是获取高纯度蛋白抗原的常用方法，主要表达系统包括：大肠杆菌系统：表达速度快，成本低，适合非糖基化蛋白酵母系统：可进行简单糖基化修饰，产量适中昆虫细胞系统：糖基化模式接近高等真核生物哺乳动物细胞系统：最接近天然修饰，但成本高表达策略包括融合标签(如His标签、GST标签)以便后续纯化，以及优化表达条件(温度、诱导剂浓度、时间等)。蛋白纯化方法蛋白纯化通常采用多步骤策略，常用方法包括：亲和层析：利用特异性结合，如His标签蛋白的镍柱纯化离子交换层析：基于蛋白质等电点差异分离凝胶过滤层析：基于分子大小进行分离疏水相互作用层析：基于蛋白表面疏水性差异纯化后需进行SDS、Westernblot等方法验证纯度和完整性。对于免疫原，应尽量保持蛋白的天然构象，避免强变性条件。蛋白质抗原还可从天然来源提取，如组织提取物、微生物培养物等。提取过程通常包括匀浆、盐析、离心和层析等步骤。天然提取的蛋白保持原有构象，但纯度控制较难，需特别注意去除可能干扰的杂质成分。多肽抗原的设计与合成抗原表位预测多肽抗原设计的第一步是预测蛋白质上的潜在B细胞或T细胞表位。表位预测方法包括：亲水性分析：Kyte-Doolittle图谱等表面可及性分析：预测暴露在蛋白表面的氨基酸柔性区域分析：结构灵活的区域更可能形成表位生物信息学算法：如ABCpred、BepiPred等结构信息分析：基于已知三维结构的表位预测理想的肽段抗原长度通常为10-20个氨基酸，具有良好的溶解性和免疫原性。对于大蛋白，可选择多个预测表位区域设计肽段抗原。多肽合成技术多肽的化学合成主要采用固相合成法(SPPS)，包括以下步骤：选择合适的固相载体（树脂）依次添加保护的氨基酸，从C端向N端延伸每次添加后去除临时保护基团重复上述过程直至完成全序列最终脱保护并从树脂上切割下多肽粗产物纯化（通常采用HPLC）合成多肽通常需要与载体蛋白（如KLH、BSA、OVA等）偶联，以增强其免疫原性。常用的偶联方法包括戊二醛法、MBS法和EDC法等。其他类型抗原的制备多糖抗原主要来源于细菌荚膜、细胞壁等结构，提取方法包括热水提取、酚-水提取和EDTA提取等。由于多糖属于T非依赖性抗原，免疫原性相对较弱，通常需要与载体蛋白（如破伤风类毒素）结合形成多糖-蛋白结合物以增强免疫应答。常用的偶联方法包括氰化溴活化法、过碘酸氧化法等。脂质抗原（如脂多糖、磷脂等）通常需要乳化或形成脂质体以增强免疫原性。核酸抗原（DNA、RNA）一般不直接用于免疫，而是通过与蛋白质结合形成核蛋白复合物后使用。对于复杂的糖蛋白抗原，需要特别注意保持其天然构象和翻译后修饰，可采用温和的提取和纯化方法，避免使用强变性条件。第八章：免疫方案设计免疫途径选择根据抗原性质和动物种类确定最优注射路线剂量与频率设计初次与加强免疫的科学安排3佐剂应用策略不同佐剂的选择与组合使用方案优化调整根据血清效价动态调整免疫计划免疫方案设计是制备高质量抗血清的关键环节，合理的免疫方案可以显著提高抗体效价和特异性。本章将详细介绍免疫途径的选择、免疫剂量与频率的确定、佐剂的应用以及方案的优化策略，帮助您设计最适合自己实验需求的免疫方案。一个优良的免疫方案应当在最小化动物使用和痛苦的前提下，最大化抗体产量和质量。通过本章学习，您将掌握科学设计和灵活调整免疫方案的方法，为成功制备高效价特异性抗血清打下坚实基础。免疫途径的选择皮下注射将抗原注射到皮肤和肌肉之间的疏松结缔组织中。这是最常用的免疫途径，适合大多数抗原类型，特别是与弗氏佐剂混合的抗原。皮下注射位点通常选择背部、腹部或颈部等松弛部位，吸收相对缓慢，抗原滞留时间长，有利于持续刺激免疫系统。皮下注射操作简便，动物痛苦小，但可能形成局部肉芽肿。肌肉注射将抗原直接注射到肌肉组织中，常用于体积较大的抗原制剂或含明矾等非油性佐剂的抗原。小动物通常选择大腿肌肉，大动物可选择臀部或肩部肌肉。肌肉注射的抗原吸收速度适中，局部反应相对较小，但操作需要更多技巧，可能对动物造成一定痛苦。该途径适合需要较快免疫应答的情况。静脉注射将抗原直接注入血液循环系统，通常用于可溶性抗原或不含佐剂的抗原。静脉注射不应使用含佐剂的抗原，以免引起栓塞。这种途径抗原分布迅速，全身暴露，但清除也快，通常需要多次注射。静脉注射技术要求较高，兔子常选择耳缘静脉，小鼠可选择尾静脉。适用于需要快速免疫应答或特定抗原类型。腹腔注射将抗原注射到腹腔内，适用于小鼠等小型动物。腹腔内有丰富的免疫