非靶向代谢组学数据分析操作流程.docxVIP

非靶向代谢组学数据分析操作流程

非靶向代谢组学数据分析操作流程

一、非靶向代谢组学数据分析的前期准备与样本处理

（一）实验设计与样本采集

非靶向代谢组学研究的第一步是科学合理的实验设计。需明确研究目的（如疾病标志物筛查、环境胁迫响应等），确定样本类型（血清、尿液、组织等）和分组方案（病例/对照、时间序列等）。样本量需满足统计学要求，通常每组不少于6个生物学重复。采集过程中需严格控制预冷条件（液氮速冻或-80℃保存），避免代谢物降解。临床样本需记录患者基本信息（年龄、性别、用药史等），动物/植物样本需统一采集部位和处理时间。

（二）样本前处理与质控

样本前处理包括代谢物提取和衍生化两步。提取多采用甲醇-乙腈-水体系（比例常为2:2:1），通过涡旋、超声破碎细胞后离心取上清。针对不同样本需优化提取方案：血浆样本需去除蛋白质（冷丙酮沉淀），植物样本需去除色素（活性炭吸附）。衍生化主要用于GC-MS分析，常用BSTFA或MSTFA硅烷化试剂。质控环节需插入混合样本（QC样本），在检测序列中每隔10个样本插入1个QC，用于评估系统稳定性。

（三）仪器平台选择与参数设置

根据研究需求选择LC-MS（高极性代谢物）或GC-MS（挥发性代谢物）平台。LC-MS推荐采用HILIC色谱柱（检测糖类等极性物质）或C18反相柱（检测脂质类），流动相为0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脱，质谱扫描范围建议m/z50-1500。GC-MS需采用DB-5MS毛细管柱（30m×0.25mm），程序升温从60℃至300℃，电子轰击电离源（EI）能量70eV。所有仪器需在分析前进行质量校准（LC-MS用利血平标准品，GC-MS用全氟三丁胺）。

二、原始数据处理与代谢物鉴定流程

（一）原始数据预处理

原始数据需经过格式转换（ThermoRAW转mzXML）、峰提取（XCMS或MS-DIAL软件）和峰对齐处理。关键参数设置包括：质量偏差（±10ppm）、保留时间窗口（±30秒）、最小峰宽（5秒）。噪声过滤采用信噪比（S/N＞3）和强度阈值（＞10^4counts）。针对LC-MS数据需进行保留时间校正（LOESS算法），GC-MS数据需扣除衍生化试剂峰。预处理后生成包含m/z、保留时间、峰面积的二维矩阵，缺失值填充采用k-最近邻法（k=5）。

（二）多元统计分析应用

采用R语言（ropls或mixOmics包）进行多维度分析：PCA用于观察组间分离趋势（前3主成分累计贡献率需＞70%），PLS-DA或OPLS-DA建立预测模型（通过200次置换检验验证过拟合风险）。差异代谢物筛选标准包括：VIP值＞1（来自PLS-DA模型），p值＜0.05（t检验或Mann-WhitneyU检验），FC绝对值＞1.5。针对时间序列数据可采用趋势分析（STEM或K-means聚类），发现动态变化模式。

（三）代谢物注释与通路分析

通过精确分子量（质量误差＜5ppm）和二级谱图匹配进行注释。数据库优先选择HMDB（人类样本）、KEGG（通路分析）、MassBank（质谱碎片）。LC-MS数据采用正负离子模式互补分析（[M+H]+和[M-H]-），GC-MS数据需匹配NIST库及保留指数。通路分析使用MetaboAnalyst5.0，重点关注KEGG通路中P值＜0.05且Impact值＞0.1的关键通路（如三羧酸循环、氨基酸代谢）。网络构建采用Cytoscape的ClueGO插件，展示代谢物-通路关联。

三、数据验证与结果解释的标准化流程

（一）生物学重复与技术重复验证

差异代谢物需通过样本队列验证（外部验证），或采用留一法交叉验证（内部验证）。技术重复要求保留时间RSD＜5%，峰面积RSD＜15%。关键代谢物建议采用标准品进行保留时间锁定（RT确认）和MRM靶向验证（三重四极杆质谱）。对于GC-MS数据，需检查衍生化效率（通过内标响应评估），必要时重新衍生化。

（二）批次效应校正方法

当数据分批次采集时，需采用ComBat或SVA算法校正批次效应。校正前后通过PCA观察批次聚类是否消除，同时确保组间差异不被过度校正。QC样本的代谢物响应强度CV值应校正至＜30%，保留时间漂移需控制在±0.5分钟内。针对不同仪器平台数据整合时，需进行量纲统一（Z-score标准化或Pareto缩放）。

（三）结果解释与假阳性控制

差异代谢物解释需结合实验背景：疾病研究需关联临床症状，植物胁迫研究需对照表型数据。假阳性控制采用FDR校正（Benjamini-Hochberg法），q值＜0.1视为显著。对于通路分析结果，需区分代谢物浓度变化与通量变化，必要时通过同位素标记实验验证。最终报告需包含原始数据（上传至Metabo