细胞生物学的研究方法.pptVIP

Chapter2

;教学内容;研究技术、研究工具;可见范围;第一节显微技术microscopy

;;—、光学显微镜

lightmicroscope;尼康E-600显微镜;分辨力〔resolution〕;表-1几种介质的折射率

;荧光显微镜fluorescencemicroscope

;落射式照明原理;荧光显微镜和普通显微镜的区别：;荧光显微镜照片〔微管呈绿色、微丝红色、核蓝色〕;激光共聚焦扫描显微镜

〔laserconfocalscanningmicroscope〕;由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。

;;激光共聚焦扫描显微境;;蓝色为细胞核，绿色为微管;;暗视野显微镜

〔darkfieldmicroscope〕

;暗视野照明方式;相差显微镜

〔phasecontrastmicroscope〕????;;莱卡倒置显微镜;;进入20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的开展，其开展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。;;;二、电子显微镜

electronmicroscope

;1932年Ruska创造了以电子束为光源的透射电子显微镜，目前TEM的分辨力可达0.2nm。;电镜与光镜的成像原理根本一样，所不同的是用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有50nm的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机〔ulra-microtome〕制作。

电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5局部构成;超薄切片

;高尔基体透射电镜图;负染技术

负染就是用重金属盐如磷钨酸或醋酸双氧铀对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品枯燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方那么没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。;肌动蛋白纤维的负染电镜照片;冰冻蚀刻freeze-etching

;冷冻断裂—蚀刻技术;冰冻蚀刻电镜照片;〔二〕扫描电子显微镜

scanningelectronmicroscope;目前扫描电镜的分辨力为6-10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的光点，那么扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/100nm=20000X。;人类血细胞SEM照片;光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较;光学和电子显微镜的根本结构;;〔三〕扫描隧道显微镜

scanningtunnelingmicroscope;扫描隧道显微镜的分辨率高，横向为，纵向可达0.001nm。它的优点是三态〔固态、液态和气态〕物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。

利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。;扫描隧道显微镜观察的DNA双螺旋结构;高压电镜;三、显微操作技术

micromanipulationtechnique;;;显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。

;细胞核移植克隆绵羊;第二节生物化学与分子生物学技术

;一、细胞化学技术

cytochemicaltechnique

;固定

目的是将细胞生前的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有：

1物理固定：血膜空气快速枯燥、冷冻枯燥。

2化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存。;显示方法

;二、免疫细胞化学

〔immunocytochemistry〕;三、放射自显影术

〔radioautography；autoradiography〕;;四、分子杂交技术

〔molecularhybridization〕;原位杂交insituhybridization;人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片;五、PCR技术

〔polymerasechainreaction〕;第三节细胞别离技术

;差速离心

〔Differencialcentrifugation〕

;;

结构;速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀;密度梯度离心

;;A等速度沉降，B等密度沉降;二、流式细胞术FlowCytometry

;flowcytometer;用流式细胞计分选细胞;第四节细胞培养与细胞杂交;