DNA序列测定课件.pptVIP

DNA序列測定DNA序列分析，即一級結構測定，是分子生物學的一項重要技術。意義：基因的分離、定位、轉錄基因產物的表達都需對DNA一級結構有基因工程載體的組建詳細瞭解基因片段的合成放射性探針的製備應用：1、對已經克隆的未知基因的序列測定，從而闡明一級結構2、對已知基因的序列測定進行檢測，對突變進行定位和鑒定，有助於探索疾病的發病機理、助於診斷DNA序列測定的主要方法有兩種，即酶促法(又稱雙去氧末端終止法)和化學裂解法，兩種方法都依賴於高解析度變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。變性聚丙烯醯胺凝膠電泳能分離長達300—500個核苷酸的單鏈寡聚核苷酸片段，並能分辨相互間長度僅差1個核苷酸的單鏈寡聚核苷酸鏈。一、Sanger雙去氧末端終止法1977年，Sanger創造了該法（一）原理：1、DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸是在3’-OH末端上進行的2、2’，3’-雙去氧三磷酸核苷（ddNTP)的3’-位去氧而失去-OH，當它摻入到DNA鏈後，3’-OH消失，DNA鏈延伸終止3、依據此原理，將待測DNA片段插入M13噬菌體載體，引物與該載體上插入待測片段的上游退火T7DNA聚合酶催化延伸分別終止於A、G、C、T的四個反應體系[因為四個反應體系中，分別加一種ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP（每個反應體系均含有四種dNTP，其中dATP為32P-dATP，以便能用放射自顯影讀序）ddNTP可隨機摻入正在延伸的DNA鏈上使鏈延伸終止]如：A管中加ddATP，管內所有新合成的DNA鏈都是以A結尾的不同長度的片段，而且這些片段都帶有放射性其他管則分別是以G、C、T結尾的不同長度的DNA片段4、變性聚丙烯醯胺凝膠電泳能分離差別僅一個堿基的寡聚單鏈核苷酸，所以A、G、C、T四種反應體系的產物在電泳凝膠中相鄰排列，所以在閱讀凝膠電泳的放射自顯影圖象時，由下至上按前、後順序即可將DNA的核苷酸順序讀出（二）主要反應1、含有四種dNTP（其中一種以同位素標記）和一種ddNTP的DNA聚合反應。2、範本與引物退火反應3、鏈延伸反應與終止反應4、反應終止後得到的同位素標記的DNA分子，經加熱變性，電泳分離，測序膠配成3%--20%之間的不同濃度5、將凝膠與X-光膠片直接接觸暴光，顯影、定影後直接從X-光片上讀出DNA片段的連續序列在雙去氧鏈終止法測序反應中，常使用失去5??3?外切核酸酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段或T7DNA聚合酶，來催化合成待測DNA範本序列的新生互補鏈。適當地調整反應試管中ddNTP和dNTP的比例(通常為ddNTP／dNTP=1：10)，能夠獲得良好的電泳帶譜模式，使得DNA條帶分離效果較佳。適當降低ddNTP對dNTP的濃度比例，可減少鏈終止的機會，從而增加反應體系中互補新生鏈的長度，配合使用較長的凝膠和低濃度聚丙烯醯胺電泳分離，有利於提高解析度，即增加可判讀核苷酸的順序。二、Maxam-Gilbert化學裂解法該法由Maxam、Gilbert等人創建，用來測定DNA序列。Maxam-Gilbert法的基本原理是，用化學試劑處理具末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應混和物，經凝膠電泳按大小分離和放射自顯影，便可根據X線片底板上顯示相應帶譜，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。