荧光检测原理.ppt

**********************************遗传病通常是由于人体生殖细胞或受精卵的遗传物质发生而引起的疾病。**遗传疾病的早期诊断荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。第31页，共49页，星期日，2025年，2月5日突变检测原理锚探针突变探针突变探针Tm值较锚探针低5℃不完全配对完全配对第32页，共49页，星期日，2025年，2月5日突变检测原理不完全配对完全配对温度低 中 高第33页，共49页，星期日，2025年，2月5日FactorV点突变检测第34页，共49页，星期日，2025年，2月5日ForwardPrimerReversePrimerDNACGCCGCLCRed640LCRed705扩增子HybprobePair1HybprobePair2双点突变的检测原理第35页，共49页，星期日，2025年，2月5日双位点双色检测WithoutcccWithcccMut1+Mut2WT1+WT2Het1+Het2H20F2F3第36页，共49页，星期日，2025年，2月5日母婴传播的监控荧光PCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。第37页，共49页，星期日，2025年，2月5日肿瘤的诊断荧光PCR的作用：可对原癌基因的突变和易位等作出检测。可对原癌基因的mRNA进行定量分析。有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。探索癌变发生机理的研究提供参考。区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。第38页，共49页，星期日，2025年，2月5日荧光PCR在血液筛查中的应用第39页，共49页，星期日，2025年，2月5日NAT(NucleicAcidAmplificationTesting)NAT应用于血液筛查的意义血液筛查现状筛查方法：免疫学输血危险性来源：窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误NAT可显著缩短窗口期，提高输血安全性HBV：缩短6-15天HCV：缩短41-60天HIV：缩短10-15天第40页，共49页，星期日，2025年，2月5日急性感染时期HIV的标志物第41页，共49页，星期日，2025年，2月5日急性感染时期HCV的标志物第42页，共49页，星期日，2025年，2月5日急性感染时期HBV的标志物第43页，共49页，星期日，2025年，2月5日病毒颗粒DNARNAFQ-PCRRT-FQPCR裂解荧光信号检测核酸纯化系统多通道荧光PCR自动检测系统荧光PCR检测流程自动加样第44页，共49页，星期日，2025年，2月5日多样本混合（Minipool）规格：16-96donations“Pool”是为了加快筛查的进度和降低成本，将多袋血浆进行混合后进行检测。“Pool”的规格取决于临界阳性和所用NAT试剂的检测限度。(据文献，PEI要求欧盟所有原料血浆必须进行HCV-RNA的NAT检测，单份血源的检测限度应达到5000IU/ml，约1.35~2.4×104geq/ml;目前FDA要求单份血源的RNA（HIV/HCV）检测限度应达到5000copies/ml)筛查方法：递减法矩阵法第45页，共49页，星期日，2025年，2月5日递减法第46页，共49页，星期日，2025年，2月5日矩阵法第47页，共49页，星期日，2025年，2月5日成本分析前提：试剂盒灵敏度（＜500copies/ml)24minipool（矩阵法筛选）阳性检出率=1/10000以10000donars为例：试剂用量:473每份筛查成本=473*每份试剂费用/10000=0.0473*每份试剂费用第48页，共49页，星期日，2025年，2月5日感谢大家观看第49页，共49页，星期日，2025年，2月5日**************Taqman原理：除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5’端标记一个荧光基团，3’标记另一个荧光基团。此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光基团（发生FRET），因此正常情况下该探针检测不