《大熊猫基因资源库构建技术规程》DB51T3245-2025.docxVIP

ICS65.020.99

CCSB65

DB51

四川省地方标准

DB51/T3245—2025

大熊猫基因资源库构建技术规程

2025-03-19发布2025-04-19实施

四川省市场监督管理局发布

DB51/T3245—2025

I

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4基本要求 1

5大熊猫组织库构建技术 2

6大熊猫精子库构建技术 2

7大熊猫体细胞库构建技术 3

附录A（资料性）大熊猫资源保存登记表 5

附录B（资料性）大熊猫精液与体细胞资源保存相关试剂配制 8

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II

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由四川省林业和草原局提出、归口、解释并组织实施。

本文件起草单位：成都大熊猫繁育研究基地。

本文件主要起草人：侯蓉、刘玉良、安俊辉、王东辉、陈依娇、陈佳松、蔡志刚、王海瑞、李媛。

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1

大熊猫基因资源库构建技术规程

1范围

本文件规定了大熊猫组织、精液及体细胞的采集与保存技术要求。

本文件适用于大熊猫基因资源库的构建。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T5458

GB/T40365

GB/T42398

3术语和定义

液氮生物容器

细胞无菌检测通则

细胞培养洁净室设计技术规范

本文件没有需要界定的术语和定义。

4基本要求

4.1器具准备及高温灭菌

4.1.1玻璃器皿

玻璃器皿使用前宜放入5%稀盐酸中浸泡12h，再用手工或超声波清洗器在加有洗涤剂的温热水中进行刷拭。洗净的玻璃器皿用牛皮纸封口后进行高压湿热灭菌（120。C，20min），干燥后待用。

4.1.2金属制品

使用之前进行高压湿热灭菌（120。C，20min），干燥后待用。

4.1.3塑料制品

枪头高压湿热灭菌（120。C，20min），干燥后待用。

4.1.4其他制品

毛巾及纱布清洁后进行高压湿热灭菌（120。C，20min），干燥后待用。

胶塞、吸管胶头、移液枪用75%酒精擦拭消毒，待酒精挥发尽后使用。

4.2细胞分离培养工作区条件

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2

细胞分离培养工作区一般由缓冲间与无菌室组成。其中，缓冲间应设有更衣柜和紫外灯，无菌室符合GB/T42398的要求，宜为万级以上的层流室，应配备超净工作台和紫外灯。紫外灯的强度为不少于

1.5W/m3，紫外线灯管距地面不应超过2.5m，使用前照射20min～30min。

5大熊猫组织库构建技术

5.1组织采集

大熊猫死亡后，尽快获取其各类组织样本，宜优先保存脏器组织（如心、肝、脾、肺、肾、卵巢、睾丸），用镊子夹着组织在PBS、生理盐水或无菌水中迅速漂洗样本3次～5次，确保组织无明显的血渍和污物。所有器械、器皿及溶液宜预先用DEPC处理，以避免RNA酶污染。

5.2组织冻存

将组织用眼科剪或手术剪剪成0.2cm3～0.5cm3大小的组织块，装入2mL冻存管中（管壁应标注样本主要信息）。样本宜在-80。C超低温冰箱或液氮中冷冻保存。填写大熊猫组织资源保存登记表（参见表A.1）。

6大熊猫精子库构建技术

6.1精液采集

清理大熊猫直肠内的粪便，对于位置较深而难以清理的粪便，用温热生理盐水灌肠清理残余粪便。再用接近体温的生理盐水冲洗大熊猫的阴茎及包皮。电极棒加涂石蜡油后插入距直肠末端约1/3处并确保电极区抵住直肠上壁。调节电刺激采精仪，电压2V～6V，一般采用1个～3个刺激系列，电刺激强度由低到高，每个刺激系列之间需间隔1min～5min，出现射精立刻停止刺激，将精液收集到集精杯中。

6.2精液评估

6.2.1精液采集后，对采精量、pH值、精子密度、精子活力、精子运动状态及精子畸形率进行检测，并填写大熊猫精液资源保存登记表（参见表A.2）。

6.2.2采精量