离子交换层析 (2).ppt

*海南大学农学院wss*1.装柱与加样量样品的准备样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品的不溶物应在透析后或凝胶过滤前以离心法除去。2.洗脱原则：增加离子强度、改变pH值方式：梯度洗脱（Gradientelution）阶段洗脱(Stepwiseelution)第62页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*第63页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*离子强度的线性梯度洗脱曲线p86盐浓度吸收曲线第64页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*离子强度非线性梯度(阶梯式洗脱曲线)第65页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*影响梯度洗脱速率变化的因素A：当CA、CB的浓度确定后，总体积V越小，梯度速率变化越快。ABB：当体积V确定时，CB－CA差值越大，梯度速率变化越快。0.50.40.30.20.10.50.40.30.20.1Vt1Vt2第66页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*比较线性梯度与阶梯式梯度洗脱显示：在样品组分、柱子规格、缓冲液成份、洗脱速度相似的条件时，其分辨率有差异。但并未表现明显优势。依据实验经验，当分离物各组分差异较小时，选用线性梯度；差异较大则选用阶梯式梯度，以减小体积和节省时间。第67页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*疏水性离子交换剂具有如下特性而被广泛应用：大量的活性基团较高的交换容量良好的机械强度稳定的物理化学性质均匀的球形颗粒、型号齐全以及丰富的产品第30页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*2.亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂的基质是一类天然的或人工合成的、与水结合力较大的物质。有：纤维素Sephacel、交联葡聚糖Sephadex交联琼脂糖Sepharose第31页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*1）纤维素Sephacel离子交换剂基本结构:以微晶纤维素为基质，化学方法引入电荷基团，构成各种阳离子、阴离子交换剂;示弱阴离子树脂的结构（DEAE-Sephacel）BeadedCellulose-O-CH2-CH2N+-H-Cl-CH2CH3CH2CH3第32页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*第33页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*2)交联葡聚糖Sephadex离子交换剂以交联葡聚糖G－25和G－50为基质，化学法引入电荷基团构成各种阴离子、阳离子交换剂。（DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex）。DEAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-QAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-CH2-CH(OH)-CH3-Cl-CH2CH3CH2CH3CH2CH3CH2CH3第34页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*第35页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*3)琼脂糖Sepharose离子交换剂以交联琼脂糖CL-6B为基质，化学法引入电荷基团构成阳离子交换剂CM－SepharoseCL-6B和阴离子交换剂DEAE-SepharoseCL-6B。CM(SepharoseCl-6B)-O-CH2-C-02Na+DEAE-SepharoseCl-6B-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-CH2-CH3CH2-CH3第36页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*亲水性离子交换剂的结构琼脂糖离子交换剂的基本结构以交联琼脂糖CL－6BSepharose为基质。其网孔的大小通过交联剂的比例调节，适合分离各种不同分子量的物质。第37页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*ScanningelectronmicrographofanagarosegelMagnificationx50,000Ref: AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity1995第38页，共85页，星期日，2025年，2月5日*海南大学农学院wss*