基于RAA和CRISPR-Cas12a系统的禽毛滴虫快速检测方法建立与应用.pdf

摘要

禽毛滴虫（Trichomonasgallinae）是一种广泛寄生于家禽和野生鸟类上消化道的

原虫。禽毛滴虫病通常导致禽类出现口腔溃疡或淡黄色干酪样结节，引发进食困难、

呼吸受阻，甚至是死亡，严重危害全球养鸽业和野禽种群健康。由于缺乏安全有效的

禽毛滴虫病疫苗，因此在感染早期实现快速诊断和及时治疗十分有必要，但传统人工

Recombinase-aided

镜检却常常出现漏检情况。近年来，重组酶介导等温核酸扩增技术（

amplification,RAA）和CRISPR-Cas12a系统的开发应用，让简便、快捷且灵敏地检

测病原成为可能，也为禽毛滴虫病的检测提供了新思路。

RAACRISPR-Cas12a

本研究旨在基于和系统建立起三种不同形式的禽毛滴虫快

速检测方法，实现现场、快速、灵敏地检测禽毛滴虫。其中，RAA-LFD方法使用生

物素（Biotin）和荧光基团（FAM）标记的引物和探针参与RAA扩增，结合侧向层

析试纸条（LFD）将扩增结果可视化；RAA-CRISPR-Cas12a-FQ和

RAA-CRISPR-Cas12a-FB方法分别使用FAM/淬灭基团（BHQ1）和FAM/Biotin修饰

的探针参与CRISPR-Cas12a反应，结合荧光检测和LFD将扩增结果可视化。以禽毛

Fe-Fe-HYD4RAA3crRNACRISPR

滴虫氢酶基因（）作为靶序列，设计了对引物和条（

RNA），通过基础RAA反应和荧光检测筛选出了最优引物RAA4和最具激活效率的

crRNA4，分析出了RAA最佳反应时间为40min，Cas12a最佳切割时间为40min。

灵敏度和特异性评价显示，以上建立的三种方法检出限为27.8拷贝Fe-HYD标

准质粒每反应，灵敏度与qRT-PCR相当，是常规PCR的100倍，且与其他病原DNA

无交叉反应。实用性评价显示，三种方法与qRT-PCR的检测一致性为100%。总的来

说，三种方法的检测效果优于普通PCR，与qRT-PCR相当，且整个过程可在40-80min

内完成，证实构建的RAA-LFD、RAA-CRISPR-Cas12a-FQ和RAA-CRISPR-Cas12a-FB

方法具有高灵敏度、特异性和实用性。本研究基于RAA和CRISPR-Cas12a系统建立

的三种高效的检测方法，有潜力成为现场检测禽毛滴虫的替代工具。

关键词：禽毛滴虫；等温扩增技术；CRISPR-Cas12a；可视化；快速检测

II

目录

第一章绪论1

1.1禽毛滴虫概述1

1.1.1病原体与生活史1

1.1.2致病机理2

1.2禽毛滴虫病概述2

1.2.1临床症状及病理变化2

1.2.2流行病学3

1.2.3诊断4

1.2.4防治8

1.3等温扩增技术在病原检测方面的应用9

1.4CRISPR-Cas12a系统在病原检测方面的应用13

1.5等温扩增技术和CRISPR-Cas12a系统的联合应用15

1.6本研究的目的与意义17

第二章材料与方法19

2.1材料19

2.1.1试验材料19

2.1.2主要试剂及耗材19

2.1.3主要仪器及设备20

2.1.4主要试剂配制21

2.2方法21

2.2.1禽毛滴虫分