酶蛋白的化学修饰.ppt

*十、亲和修饰又名专一位点修饰，是指修饰剂只专一地与酶分子某一个位点上的某一个基团发生反应，而与此位点以外的同一种或不同种基团都不发生作用的修饰方法。为对某一个特定位点的基团进行选择性的修饰，根据酶的底物结构特点和酶的催化机制，研究开发了亲和试剂。亲和试剂又称为亲和标记试剂，具有与酶作用底物相类似的结构，可以专一性地与酶的活性部位结合，而引起酶活性的不可逆抑制，故又称为专一性不可逆抑制剂。结合型（Ks型）不可逆抑制剂催化型（Kcat型）不可逆抑制剂第30页，共77页，星期日，2025年，2月5日*第31页，共77页，星期日，2025年，2月5日*第32页，共77页，星期日，2025年，2月5日*第33页，共77页，星期日，2025年，2月5日*第四节酶的组成单位置换修饰酶分子的基本组成单位包括氨基酸和核苷酸，是酶的化学结构和空间结构的基础。酶分子组成单位的改变将引起酶的化学结构和空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能。酶蛋白的基本组成单位是氨基酸，将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。酶RNA的基本组成单位是核苷酸，将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法，称为核苷酸置换修饰。第34页，共77页，星期日，2025年，2月5日*一、组成单位置换修饰的作用提高酶活力增强酶的稳定性使酶的专一性发生改变二、定点突变技术定点突变（sitedirectedmutagenesis）是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。20世纪80年代发展起来，常用于蛋白质工程（ProteinEngineering）和酶分子组成单位置换修饰。第35页，共77页，星期日，2025年，2月5日*定点突变技术用于酶分子修饰的过程新的酶分子结构的设计突变基因碱基序列的确定突变基因的获得根据设计，用DNA合成仪合成有1-2个碱基被置换了的寡核苷酸，再以此为引物通过聚合酶链反应（PCR）或M13质粒等定位突变技术获得所需的大量突变基因。聚合酶链反应技术简称PCR（polymerasechainreaction）技术，是一种DNA扩增技术，其基本过程包括：双链DNA的热变性（解链），引物与单链DNA的退火结合，引物的延伸等3个步骤。新酶的获得第36页，共77页，星期日，2025年，2月5日*金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的功能和特性发生改变的修饰方法作用：了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，有利于阐述酶的催化作用机制，并可能提高酶活力，增强酶的稳定性，甚至改变酶的某些动力学性质。第37页，共77页，星期日，2025年，2月5日*1.提高酶活力例如，α-淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些则含有镁离子或锌离子等其他离子，所以一般的α-淀粉酶是杂离子型的。如果将其他杂离子都换成钙离子，则可以提高酶活力并显著增强酶的稳定性。结晶的钙型α-淀粉酶的活力比一般结晶的杂离子型α-淀粉酶的活力提高3倍以上，而且稳定性大大增加。再如，将锌型蛋白酶的锌离子除去，添加一定量的钙离子，置换成钙型蛋白酶，其活力可以提高20-30%。2.增强酶的稳定性例如，铁型超氧化物歧化酶(Fe-SOD)分子中的铁离子被锰离子置换，成为锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)后，其对过氧化氢的稳定性显著增强，对叠氮钠(NaN3)的敏感性显著降低。3.改变酶的动力学特性例如，酰基化氨基酸水解酶的活性中心含有锌离子，用钴离子置换后，其催化N-氯-乙酰丙氨酸水解的最适pH值从8.5降低为7.0，同时该酶对N-氯-乙酰蛋氨酸的米氏常数Km增大，亲和力降低。第38页，共77页，星期日，2025年，2月5日*金属离子修饰的过程：在经过分离纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。用一定量的另一种金属离子加到酶液中酶蛋白与新加入的金属离子结合，得到经过金属离子置换后的酶。第39页，共77页，星期日，2025年，2月5日*第五节酶分子的物理修饰通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰。第40页，共77页，星期日，2025年，2月5日*物理修饰的作用了解在不同物理条件下，特别是在高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH值、有毒环境等极端条件下，由于酶分子空间构象的改变而引起的酶的特性和功能的变化情况。极端条件下酶催化特性的研究对于探索太空、深海、地壳深处以