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荧光猝灭法在蛋白相互作用中的应用
2012年04月21日
荧光猝灭法
•荧光猝灭
•广义上说，是指任何可以使荧光强度降低的作用。
•但狭义的定义仅指由于荧光物质分子与溶剂分子或其
它溶质分子的相互作用引起的荧光强度降低的现象。
•这种使荧光强度下降的物质称为荧光猝灭剂
•猝灭过程可能发生于：
•猝灭剂与荧光物质的激发态分子之间的相互作用——
动态猝灭
•也可能是发生于猝灭剂与荧光物质的基态分子之间的
相互作用——静态猝灭
动态猝灭
•在动态猝灭过程中，荧光物质的激发态分子通过与猝
灭剂分子的碰撞作用，以能量转移的机制或电荷转移
的机制丧失其激发能而返回基态。
•动态猝灭效率受到荧光物质激发态分子的寿命和猝灭
剂的浓度控制。
•通过公式推导得Stern-Volmer方程式：
F0/F=1+KsV[Q]=1+Kqτ0[Q]
KsV:动态猝灭常数——反映了生物大分子与荧光猝灭剂分子彼此扩
散和相互碰撞到达动态平衡时的量效关系；
Kq:动态荧光猝灭速率常数——反映了体系中分子的彼此扩散和相
互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率的影响。
τ0：为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命
KsV=Kqτ0
静态猝灭
•在静态猝灭的特征是猝灭剂与荧光物质分子在基态时
发生配合反响，生成不发光的基态化合物，这种基态
复合物吸收光子后并不发射光子，而是很快返回到基
态。
•
•推导公式：
F0/F=1+Ks[Q]Ks：静态猝灭常数
•双倒数公式*：
此上公式适用于配合比为1:1的情况下。
•对于多结合位点的生物大分子有*：
准确区分动态猝灭和静态猝灭*：
•对于动态猝灭，荧光物质的吸收光谱一般不会改变；而静态猝
灭形成的基态配合物往往会导致吸收光谱的改变；
•动态猝灭依赖于扩散，因此荧光物质的猝灭常数将随温度的升
高而增大，而对于静态猝灭，温度升高那么导致基态配合物稳
定性下降，因此静态猝灭常数将随温度的升高而减小；
•对于动态猝灭，猝灭剂的存在会缩短荧光分子激发态的寿命；
而对于静态猝灭，猝灭剂的存在那么并不改变荧光分子激发态
的寿命。
•各类荧光猝灭剂最大动态荧光猝灭速率常数约为
2.0x10-10L·mol-1；生物大分子的荧光平均寿
命约为10-8s；根据KsV的值可求出Kq的大小，如
果所求得的Kq值远大于2.0x10-10L·mol-1，那
么此猝灭过程为静态猝灭。
应用——研究氧氟沙星与人血清蛋白相互作用
*
先做反响的动态猝灭的
Stern-Volmer曲线，根据直线
的斜率计算出KsV。
根据公式KsV=Kqτ0，进而得
出Kq，远大于2.0x10-10
L·mol-1，判定反响是静态猝
灭过程。
再通过多结合位点的生物
大分子静态猝灭推导公式：
根据直线斜率确定结合位
点数n=0.9≈1
•确定反响属于静态猝灭过
程，进而运用静态猝灭双
倒数公式求解结合常数：
•得到
K=1.44×105(mol/L)-1
谢谢欣赏
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