基于CRISPR-Cas9的亮斑扁角水虻神经肽F及其受体的功能研究.pdf

摘要

联合国粮食及农业组织预测，全球人口数量在未来将会持续增长，对食物的需求

也将急剧增加，可能导致粮食和蛋白危机。经济昆虫转化率高、生长速度快、繁殖能

力强，并且富含蛋白质、脂肪和矿物质，目前全球已有超过2000种昆虫被确定为可

食用昆虫，为应对未来粮食危机提供了新的可能。亮斑扁角水虻（Hermetiaillucens）

幼虫能以有机废弃物为食并转化为自身蛋白和脂类而被广泛应用于资源循环利用，其

个体取食生长、繁殖发育直接影响转化效率。在模式和非模式多种昆虫中，神经肽F

及其受体参与调控个体生长发育、代谢和生殖诸多方面，然而它们在亮斑扁角水虻生

长发育中的作用尚未见报道。本研究通过CRISPR-Cas9技术对亮斑扁角水虻NPF和

NPFRFNPFNPFR

基因进行功能研究，探索神经肽（）和受体基因对幼虫生长发

育和成虫行为的影响，以期为亮斑扁角水虻高效转化品种遗传改良和应用提供分子靶

标和理论依据，为解决当下蛋白短缺和环境污染问题提供新思路。主要研究结果如下：

1.克隆获得NPF和NPFR基因

从亮斑扁角水虻中鉴定克隆NPF和NPFR基因并进行生物信息学分析，结果

显示NPF分子量大小为10825.44D，理论等电点为9.30，疏水性为-0.510，不稳定

70NPFR48231.06D9.330.356

系数为。分子量大小为，理论等电点为，疏水性为，

不稳定系数为115.45。通过SWISS-MODEL得到NPF和NPFR基因的蛋白质三级

结构。通过构建系统发育树，发现NPF和NPFR基因与其它双翅目昆虫在一个分

支上，亲缘关系相近。

2.NPF和NPFR基因时空表达模式

通过对NPF和NPFR基因表达模式分析发现，NPF和NPFR基因在不同发

育阶段和不同组织内具有表达特异性。NPF基因在成虫内的含量高于幼虫，并且在

雌性成虫的表达量高于雄性成虫，在幼虫的各个龄期均表达，在预蛹期表达量最高。

NPFR基因在幼虫中的表达量高于成虫，并且在幼虫蛹期表达量最高，和NPF基因

NPFNPFR

同样在雌性成虫的表达量高于雄性成虫。不同组织表达模式分析发现，和

基因在足、翅膀、触角、表皮、脂肪体、头部中均表达，并且NPF基因在头部的表

达量显著高于其他组织，NPFR基因在表皮中的表达量显著高于其他组织。

3.筛选纯合突变体

通过胚胎显微注射之后的G0代个体依据其性别分别单独与野生型异性个体（WT）

G1G1G2

进行回交，繁殖产生代。其所产的代个体进行自交并繁殖产生代，每一

代取10-20粒卵提取其基因组进行突变检测。由NPF突变体测序结果可以看出在靶

标位点位置测序峰图产生突变且峰图接近1：1，仍存在杂峰，不能作为纯合突变体；

NPFR11

由突变体测序结果可以看出在靶标位点位置测序峰图无杂峰且共缺失个

III

碱基，我们把筛选后的纯合突变体标记为NPFR¯。

4.NPFR基因敲除对亮斑扁角水虻的影响

对亮斑扁角水虻的幼虫（生长发育历期、表型、体重、体长、腹宽、相对取食率、

食物利用率）及成虫（求偶行为、交配对数、交配时长、单雌产卵量、孵化率）生物

学性状检测。结果发现NPFR基因突变体组幼虫与野生型组幼虫对比存在明显差异，

NPFR组幼虫从四龄开始出现生长发育延迟现象，幼虫时期比WT组延迟了3d；NPFR

组幼虫表型