蛋白质分子基础蛋白质制备.ppt

双向电泳双向电泳:由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。1975年，O’Farrell首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白质组学的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。第31页，共55页，星期日，2025年，2月5日第32页，共55页，星期日，2025年，2月5日第33页，共55页，星期日，2025年，2月5日PAGE电泳分离的大分子的检测考马斯亮蓝染色法可检出0.3~1ug的蛋白质。银染色法银离子与蛋白质以盐或配价络盐的形式结合，用甲醛将银离子还原为可见的银颗粒。可检测ng水平的蛋白质。荧光染色技术荧光合成物质与PAGE上的蛋白质发生反应，发出强烈的荧光，可检测到PAGE中的蛋白质。第34页，共55页，星期日，2025年，2月5日免疫印迹法蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。具体操作为经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。第35页，共55页，星期日，2025年，2月5日免疫印迹法抗原包被的实验膜条特异性人抗体标记的二抗标记第36页，共55页，星期日，2025年，2月5日免疫印迹法第37页，共55页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的结晶第38页，共55页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的结晶可以作为蛋白质提纯的方法之一。蛋白质纯度达到一定值时可以结晶。通过反复重结晶可以除去其中的杂质，使蛋白质得到更大程度的纯化。蛋白质结晶体是比较稳定的结构，所以结晶可以作为一个稳定的储存的方法。在蛋白质结晶之后，可以提供作X射线衍射分析用的材料，来分析蛋白质的结构等数据。第39页，共55页，星期日，2025年，2月5日关于蛋白质分子基础蛋白质制备第1页，共55页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的电泳第2页，共55页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的电泳分离电泳分离的原理:蛋白质是两性电解质,在一定的pH下,可以解离为带电荷的离子。在电场中可以电泳移动。电泳迁移率：带电颗粒在溶液中迁移速度的快慢，用电泳迁移率(M)表示：M为迁移率；dL为颗粒移动的距离；L为通电的时间。E为两个电极之间的电势差。M=EtdL第3页，共55页，星期日，2025年，2月5日第4页，共55页，星期日，2025年，2月5日影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。电场与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。支持介质纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。第5页，共55页，星期日，2025年，2月5日第6页，共55页，星期日，2025年，2月5日影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。电场与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。支持介质纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。第7页，共55页，星期日，2025年，2月5日第8页，共55页，星期日，2025年，2月5日影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。电场与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。支持介质纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。第9页，共55页，星期日，2025年，2月5日缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。离