巴斯德毕赤酵母表达系统.pptxVIP

报告人：彭平平

起源及背景巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是8O年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。130年前KoichiOgata首次发现有些酵母可以利用甲醇为唯一的碳源和能源.270年代Philipspertoleum公司就开发出高密度连续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。3

80年代由Philipspertoleum公司合作开发毕赤酵母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。1993年Philipspertoleum公司委托Invrtigone公司代理毕赤酵母表达系统的产品。

毕赤酵母与其它表达系统相比有许多优点毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株毕赤酵母甲醇氧化酶(alcoholoxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达

毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离01毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用02使用方便、简单，而且成本较低03

结构特点单细胞微生物兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量的蛋白

合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，亦不会对细胞产生毒害1在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在AOX催化下产的H202对细胞的毒害。2微体（也称过氧化物酶体）

醇氧化酶（AOX）甲醇AOX甲醛H2O2微体细胞

毕赤酵母质粒载体

穿梭质粒：是指人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。同源基因重组：同源染色体的非姐妹染色单体的交叉互换引起的互换重组

pPIC9k质粒图谱AOX--醇氧化酶S---分泌信号MCS–多克隆位点TT---终止信号HIS4--组氨醇脱氢酶Kanamycin---抗卡拉霉素基因pBR322---大肠杆菌的复制起始位点Ampicillin---抗氨苄青霉素基因

外源蛋白的引入表达

Mut5’AOX基因3’AOX基因表型Mut+存在存在正表型Muts缺失存在缓慢型Mut-缺失缺失负型

选择过程HIS4缺陷培养基G418酵母培养基低高G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性基因能对抗G418对酵母的毒性导入质粒

一般分为三个阶段：成长期，该阶段以甘油为碳源，主要目的是收获一定的菌量，该阶段一般采取分批补料的方式进行；过渡期，随成长期的结束酵母即进入过渡期，该期不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除对AOX1启动子阻遏；诱导期，即当甘油被消耗尽，过渡期结束时，在发酵液中流加甲醇诱导重组蛋白的表达。

应用举例

依森泰德（Exenatide）是首个合成肠促胰岛素类似物，具有多种降血糖作用。HAS：人血清白蛋白

ExenatideTwiceaday2.4h被代谢ExenatideHSAPCR基因重组ExenatideHSAOnceaweek

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