高效液相色谱方法及应用.ppt

二、生化方面主要方向是分析嘌呤、嘧啶基的核苷或核苷酸及具有相应的肽和蛋白质。①在细胞核中有种类繁多的核苷酸，可用不同的检测器或酶转移检测器或利用酶反应进行定性测定。用离子交换柱和缓冲游泳梯度淋洗。C18柱用含磷酸的缓冲水溶液的梯度淋洗法均能得到满意的结果。第23页，共34页，星期日，2025年，2月5日②分离RNA、DNA及碎片现在使用硅烷化的硅藻土或长碳链季胺盐涂渍等在上面制成系列填充柱，已能分离t-RNA,r-RNA及DNA碎片。还可利用此技术做RNA碎片的序列分离制备工具，对生物研究起了重要的作用。③氨基酸、肽、蛋白质的分析氨基酸分析主要是制成荧光衍生物或酰氯的衍生物，然后测定其序列。近来也可用高效液相色谱的柱后衍生物法测定其序列。用四烷基氯化胺肽形成离子对或高效凝胶色谱测定蛋白质，其分离效果也很好。④酶的分析酶是在血清及其他生理样品中常有的反应产物，化学分析法操作不便，易造成误差，用色谱技术分析，具有操作简便、快速、准确的特点。第24页，共34页，星期日，2025年，2月5日第1页，共34页，星期日，2025年，2月5日色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，是一个具有强大生命力的分离分析技术。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。第2页，共34页，星期日，2025年，2月5日高效液相色谱法的特点

一、与经典液相色谱法比较经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。?高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。第3页，共34页，星期日，2025年，2月5日二、与气相色谱法比较气相色谱仅能测量在操作温度下可气化且不分解的物质，而对高沸点化合物、非挥发性物质、第4页，共34页，星期日，2025年，2月5日热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有困难，致使其应用受到了很大的限制。高效液相色谱法不受样品挥发度和热稳定性的限制，适合分离生物大分子、离子型化合物、不稳定的天然产物以及其他各种高分子化合物等。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱测量的约占20％；能用高效液相色谱测量的达到70％～80％。三、高效液相色谱法的特点1.分离效能高2.选择性高3.检测灵敏度高4.分析速度快第5页，共34页，星期日，2025年，2月5日高效液相色谱法的分类

按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类1.吸附色谱（AdsorptionChromatography）2.分配色谱（PartitionChromatography）3.离子色谱（IonChromatography）4.体积排阻色谱（SizeExclusionChromatography）5.键合相色谱法（bonded-phasechromatography）6.亲和色谱（AffinityChromatography）第6页，共34页，星期日，2025年，2月5日按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较

吸附色谱分配色谱离子色谱体积排阻色谱亲和色谱固定相全多孔固体吸附剂固定液载带在固相基体上高效微粒离子交换剂具有不同孔径的多孔性凝胶多种不同性能的配位体键联在固相基体上流动相不同极性有机溶剂不同极性有机溶剂和水不同pH值的缓冲溶液有机溶剂或一定pH值的缓冲溶液不同pH值的缓冲溶液，可加入改性剂分离原理吸附与解吸溶解与挥发可逆性的离子交换多孔凝胶的渗透或过滤具有锁匙结构络合物的可逆性离解第7页，共34页，星期日，2025年，2月5日高效液相色谱仪简介

1.贮液瓶2.高压输液泵