《目标基因获取》课件.pptVIP

目标基因获取：基因工程的关键步骤掌握目标基因获取技术，开启生物技术革命之门

课程概述目标基因的定义基因工程中的核心操作对象获取方法概览多种技术路线与方法选择应用领域医学、农业、工业全面应用技术发展趋势前沿技术与未来展望

什么是目标基因？基因工程的核心特定功能的基因片段转移与操作的对象功能特点编码特定蛋白质产生功能性RNA调控细胞生理活动

目标基因的重要性最终效果决定因素产物功能与特性的核心基因工程的基础所有操作的核心对象信息载体携带遗传信息的基本单位

基因工程的基本操作程序目标基因获取本课程重点基因表达载体构建为基因表达创造环境将目标基因导入受体细胞转化或转染等方法目标基因的检测与鉴定验证操作成功与否

目标基因获取方法概览化学合成人工设计短序列PCR扩增已知序列快速放大基因组文库筛选从全基因组中寻找cDNA文库筛选从转录组中获取基因组编辑定点修饰基因组

化学合成法序列设计根据需求设计碱基序列核苷酸连接化学方法连接碱基纯化与组装获得完整目标序列

化学合成法优势高度定制化可任意设计序列特定修饰可引入非天然碱基快速获取无需模板高准确度序列精确控制

化学合成法局限性长度限制通常不超过200bp长序列合成错误率增加成本考量随长度增加成本急剧上升不适合大规模合成技术挑战特殊序列合成困难GC含量高区域效率低

PCR扩增法基本原理聚合酶链式反应利用DNA聚合酶体外扩增核心要素引物配对模板DNA热稳定DNA聚合酶应用场景已知序列基因扩增特定片段快速获取

PCR扩增步骤引物设计针对目标序列两端设计特异性引物模板DNA变性高温使双链DNA分离引物退火引物与单链DNA结合延伸聚合酶合成新链

PCR扩增优势快速高效数小时内获得大量目标序列高特异性精确获取目标序列高灵敏度微量样本也可扩增操作简便设备需求低

PCR扩增注意事项1引物设计长度、Tm值、特异性需精确控制2反应条件优化温度、时间、循环数等参数调整3杂质与污染控制防止交叉污染4特殊序列处理GC含量高、重复序列需特殊处理

基因组文库筛选基因组DNA提取获取完整基因组DNADNA片段化酶切或物理方法断裂载体连接构建重组DNA分子转化与扩增获得单克隆菌落目标克隆筛选寻找含目标基因的克隆

基因组文库类型文库类型载体容量适用范围质粒文库质粒小(≤10kb)小片段基因噬菌体文库λ噬菌体中(≤23kb)中等大小基因人工染色体文库BAC/YAC大(≥300kb)大片段基因

基因组文库构建步骤DNA片段化酶切或超声处理载体连接连接酶催化转化宿主细胞电击或热激法扩增和保存培养与冷冻保存

基因组文库筛选方法探针杂交标记探针与目标序列结合放射性或荧光检测PCR检测特异性引物扩增电泳或实时荧光检测功能互补用于恢复突变体功能表型筛选与鉴定

cDNA文库筛选基本概念互补DNA文库由mRNA反转录获得反映基因表达图谱技术特点仅包含表达基因无内含子干扰组织特异性

cDNA文库优势直接用于表达无内含子干扰表达序列完整性获得完整编码序列组织特异性反映特定条件下基因表达

cDNA文库构建步骤1mRNA提取从组织中分离高质量mRNA2反转录逆转录酶合成第一链cDNA3第二链合成DNA聚合酶合成互补链4载体连接和转化构建重组质粒并转入宿主

cDNA文库筛选技术免疫学筛选抗体识别表达产物核酸杂交特异探针结合目标序列功能筛选通过功能互补鉴定

基因组编辑技术靶点设计确定目标基因位置基因组修饰通过定点编辑系统修改筛选鉴定验证编辑效果扩增培养获得稳定编辑细胞

CRISPR/Cas9工作原理sgRNA设计与合成针对目标序列设计引导RNACas9蛋白表达产生具有核酸酶活性的蛋白靶向识别与切割sgRNA引导Cas9切割特定位点细胞修复通过NHEJ或HDR修复断裂

基因组编辑应用基因敲除使特定基因失活基因插入在特定位点引入新基因基因修饰点突变或小片段替换基因调控改变基因表达水平

目标基因获取方法比较方法时间效率成本技术难度适用范围化学合成快高低短序列PCR扩增快低中已知序列基因组文库慢中高未知序列cDNA文库中中高表达基因基因组编辑中中高定点修饰

目标基因获取的关键考虑因素基因长度决定适用方法选择已知信息序列信息的完整程度宿主兼容性考虑后续表达系统需求成本与时间项目预算与时间限制

目标基因的修饰和优化密码子优化根据宿主偏好调整提高表达效率调控元件添加增加启动子等调控序列控制表达时间与水平标签蛋白融合添加功能性标签便于检测与纯化

密码子优化的重要性64密码子总数编码20种氨基酸2-6X表达提升优化后表达水平增加30%翻译效率提高密码子优化后的平均提升

调控元件的选择启动子控制转录起始决定表达强度组成型启动子诱导型启动子组织特异性启动子增强子提高转录效率可位于基因上下游增强表达水平调节表达特异性终止子停止转录信号保证转录完整性提高mRNA稳定性防止读穿转录

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