DB13T 1567-2012 葡萄品种DNA指纹鉴定方法.docxVIP

ICS65.020.01B05

DB13

河北省地方标准DB13/T1567—2012

葡萄品种DNA指纹鉴定方法

2012-07-03发布2012-07-15实施

河北省质量技术监督局发布

I

DB13/T1567—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。标准由河北省林业局提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：梁海永、杨敏生、刘兴菊、宪立杰、张军、杨立华、王进茂、甄红伟、姚伟明周晓霞、王瑞霞。

1

DB13/T1567—2012

葡萄品种DNA指纹鉴定方法

1范围

本标准规定了葡萄品种DNA指纹鉴定的方法及判定标准。

本标准适用于河北省葡萄品种鉴定及葡萄品种DNA指纹库的建立,其他省份可参照执行。

2原理

葡萄全基因组测序已经完成。不同葡萄品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可经过PCR扩增、电泳分离、显色程序绘制的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。从葡萄幼苗、叶片等组织中提取总DNA，利用SSR引物对位于不同染色体上的SSR位点进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA指纹谱带类型。

3仪器设备及试剂

仪器设备及试剂名单见参附录A。4溶液配制

相关溶液配制方法见附录B。

5操作程序

5.1样品准备

5.1.1取样量

每份送检样品至少检测3个个体，对一致性差的样品应增加检测个体至5个。

5.1.2品种比较方式

成对品种的比较:送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比较。杂交后代需提供母本与父本的样品。

品种与DNA指纹库入库品种的比较:送检样品可提供一份。将待检样品与DNA指纹库所有入库品种的指纹进行比较，筛选出指纹最相似或相同的品种作为待检品种的近似品种，然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。

5.2DNA提取

2

DB13/T1567—2012

采用改良的CTAB法。取200mg干净叶片置入1.5mL离心管中，加入500μLDNA提取液研磨碎，并加1mL洗涤液及30μLβ-巯基乙醇，充分摇匀后置冰上5min，于4℃,12000g离心8min后，洗涤一次，弃上清，再加700μL预热的CTAB缓冲液,充分混匀后，于65℃水浴60min，其间颠倒几次。然后于室温冷却4min~5min，取上清,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),混匀抽提，室温静置5min，于室温12000g离心8min。上清液移于一新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀后室温静置5min，室温12000g离心8min，取上清，重复加等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清加入等体积氯仿抽提一次，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇(-20℃)，轻轻混匀后在-20℃沉淀30分钟以上，12000g离心10min，将所得沉淀风干后溶于100μL水中，置4℃冰箱备用。其它保证DNA质量的方法也可采用，应用前需要通过微量紫外分光光度计进行DNA质量与浓度检测。

5.3PCR扩增

5.3.1SSR扩增

基本核心引物名单见附录C。

5.3.2反应体系

反应液体积为20μL，组分配制应符合表1的规定，（或按比例减少至10μL）。表1PCR反应体系

反应组分

原浓度

终浓度

反应体积μL

ddH2O

13.35

10×buffer

10×

1×

2

MgCl2

25mmol/L

2.5mmol/L

2

dNTP

2.5mmol/L

0.15mmol/L

1.2

Taq酶

5U/μL

1U

0.2

引物

20μmol/L

0.25μmol/L

0.25

DNA

30~50ng/μL

1.5~2.5ng/μL

1

5.3.3反应程序

94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

5.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

5.4.1清洗玻璃板

用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。

5.4.2组装电泳板

待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。