《病原微生物学实验室技术与应用》课件.pptVIP

病原微生物学实验室技术与应用微生物检测技术和安全操作规程

课程概述课程目标掌握微生物实验基本技能主要内容微生物检测技术与安全操作学习方法

第一章：病原微生物实验室概述基本概念了解病原微生物的定义与特性实验室分级掌握生物安全实验室等级划分安全标准学习生物安全操作规范

病原微生物的定义与分类病原微生物定义能引起人、动植物感染和疾病的微小生物细菌与病毒细菌为原核生物，病毒为非细胞型真菌与寄生虫真菌为真核生物，寄生虫体积较大

病原微生物实验室的分级四级实验室埃博拉等高致病性病原体三级实验室SARS、炭疽等危险病原体二级实验室一般致病菌如沙门氏菌一级实验室非致病微生物研究

实验室生物安全概念生物安全定义防止生物因子对人类、动植物和环境造成危害的措施包括实验室安全操作、废弃物处理和环境保护生物安全重要性保护实验人员健康防止病原体扩散确保实验数据准确维护公共卫生安全

第二章：实验室设施与设备基础设施实验室布局与环境控制安全设备生物安全柜与个人防护检测设备显微镜与分析仪器培养设备培养箱与灭菌器

实验室基本设施要求实验室布局清洁区与污染区分开通风系统定向气流，负压控制洗手消毒设施非手动水龙头，消毒液

生物安全柜Ⅰ级安全柜保护操作者和环境不保护样品1Ⅱ级安全柜保护操作者、环境和样品常用于二级、三级实验室2Ⅲ级安全柜全封闭操作用于高危病原体3使用原则预先紫外消毒操作时减少干扰气流4

高压蒸汽灭菌器工作原理121℃高压蒸汽破坏微生物结构操作步骤装载、设置参数、运行、冷却常见问题压力不足、温度偏低、灭菌不彻底解决方法定期维护、使用生物指示剂验证

显微镜的使用光学显微镜常规微生物形态观察荧光显微镜特异性标记微生物检测电子显微镜病毒等超微结构观察

其他常用设备PCR仪核酸扩增关键设备离心机样品分离处理培养箱微生物培养基础设备

第三章：实验室安全操作规程

个人防护装备（PPE）防护服一次性隔离衣连体防护服手套乳胶/丁腈手套双层防护口罩与护目镜N95口罩防溅护目镜

无菌操作技术洗手消毒操作前彻底洗手器材准备确保所有器材已灭菌安全柜操作在层流条件下进行接种环灼烧红热冷却后使用

生物安全柜的正确使用1开启程序开风机→紫外灯消毒30分钟→关紫外灯→工作区消毒2操作中注意动作轻缓→避免阻挡气流→保持工作区清洁3完成后处理清理工作区→表面消毒→紫外灯照射4关闭程序紫外灯消毒结束→关紫外灯→关风机

实验室废弃物处理固体废弃物高压灭菌后焚烧双层生物安全袋密封专人专车运送液体废弃物含氯消毒剂处理作用30分钟以上专用下水道排放尖锐物品专用硬质容器收集不过满，密封牢固高温高压处理

实验室事故应急处理事故类型识别泄漏、溅出、暴露、火灾人员撤离保持冷静，按指定路线撤离污染控制使用消毒剂覆盖污染区报告记录详细记录事件过程与处理方法

第四章：基础实验技术

微生物培养基制备1培养基种类选择根据微生物生长需求选择2成分称量配制精确计量各组分3pH调整与灭菌高压灭菌121℃15-20分钟4质量控制检查无菌性、支持力测试

接种技术平板划线法分离纯化单菌落倾注平板法测定细菌数量液体培养接种大量培养微生物

染色技术革兰氏染色区分革兰阳性和阴性细菌抗酸染色结核分枝杆菌等检测荧光染色特异性高，荧光显微镜观察

镜检技术湿片法观察活体微生物运动操作简便，不需固定染色悬滴法长时间观察微生物活动避免细菌干燥和死亡油镜观察高倍率细节观察需使用浸油增加分辨率

细菌计数方法30-300平板计数法适宜计数范围内菌落3最可能数法稀释度设置，统计阳性管数0.1比浊法麦氏比浊管比较或分光光度计

第五章：病原细菌检测技术分离培养获取纯培养物生化鉴定确定细菌种类血清学检测抗原抗体反应分子生物学检测核酸特异性识别药敏试验确定药物敏感性

细菌分离培养选择性培养基抑制非目标菌生长鉴别培养基不同菌种呈现不同颜色富集培养基促进目标菌快速生长

细菌生化鉴定API系统多种生化试验条带根据颜色变化判读用于临床常见细菌自动化鉴定系统VITEK、Phoenix系统计算机辅助判读快速出结果质谱鉴定技术MALDI-TOFMS蛋白质指纹图谱精确度高，速度快

血清学检测凝集试验抗原抗体形成可见凝集物常用于细菌菌株血清型鉴定ELISA试验酶联免疫吸附实验可定性或定量检测抗原抗体免疫荧光技术特异性荧光抗体标记直接或间接法检测

分子生物学检测常规PCR扩增特定基因片段实时荧光定量PCR边扩增边检测，可定量基因芯片技术高通量多重检测

药敏试验纸片扩散法测量抑菌圈判断敏感性微量稀释法确定最低抑菌浓度E-test方法梯度扩散技术，简便准确

第六章：病毒检测技术1分子检测特异性高，敏感度高2抗原检测快速，适合现场使用3病毒分离培养金标准，可获活病毒

病毒培养技术细胞培养观察细胞病变效应鸡胚培养流感病毒等培养方法动物接种观察临床症状与病理变化

病毒分离与鉴定1细胞病变观