《荧光和发光光度法》课件.pptVIP

荧光和发光光度法光分析技术高灵敏度检测方法应用广泛的分析手段

课程概述课程目标掌握荧光和发光光度法基本原理主要内容原理、仪器、方法和应用学习成果能独立进行荧光分析实验

第一章：光致发光基础基本概念光能量被物质吸收后重新辐射研究历史从斯托克斯发现到现代应用重要性高灵敏检测技术基础

1.1光致发光原理电子激发分子吸收光子跃迁至激发态能量释放激发态回到基态释放光子Jablonski能级图直观展示能量转换过程

1.2荧光与磷光的区别荧光寿命短（纳秒级）单重态→基态跃迁光停即灭磷光寿命长（毫秒至小时）三重态→基态跃迁余辉现象

1.3发光材料类型有机荧光材料荧光素、罗丹明等1无机荧光材料稀土掺杂材料、磷光体2量子点尺寸可调光谱特性3

1.4斯托克斯位移定义激发波长与发射波长之差影响因素溶剂极性、分子结构应用意义减少背景干扰，提高信噪比

第二章：荧光光谱仪器系统集成各部件协同工作数据处理信号转换与分析控制系统参数设置与反馈核心组件光源、单色器、样品室、检测器

2.1荧光光谱仪基本结构1光源提供稳定激发光2单色器选择特定波长3样品室放置待测物4检测器收集发射光

2.2激发光源氙灯连续光谱，强度高汞灯线状光谱，特定波长强度大激光器单色性好，方向性强

2.3单色器类型1nm棱镜单色器利用折射原理0.1nm光栅单色器衍射分光效率高10nm滤光片简单经济易更换

2.4检测器光电倍增管响应快，灵敏度高CCD检测器二维成像，空间分辨光电二极管阵列同时多波长检测

2.5仪器性能参数

第三章：荧光光谱测量样品制备溶解、稀释、调节条件参数设置波长、扫描速度、狭缝宽度数据采集光谱记录与分析

3.1激发光谱定义固定发射波长，扫描激发波长测量方法监测特定发射波长的强度变化应用确定最佳激发条件

3.2发射光谱1特征反映分子能量状态分布2测量步骤固定激发波长，扫描发射波长3数据解释峰位置、强度、形状分析

3.3同步荧光光谱原理激发和发射单色器同步扫描优势谱峰变窄，选择性提高应用实例混合物分析，结构表征

3.4时间分辨荧光光谱荧光寿命激发态平均存在时间分子环境敏感指标测量技术时域法：脉冲激发后衰减频域法：相位差和调制度数据分析指数拟合寿命分布计算

3.5荧光偏振1分子旋转运动研究大分子结合检测2偏振度计算P=(I‖-I⊥)/(I‖+I⊥)3平行垂直光强测量偏振片调节光路4偏振光激发选择性激发荧光分子

第四章：荧光定量分析样品制备标准溶液配制标准曲线绘制信号与浓度关系样品测量荧光信号获取结果计算浓度反推与校正

4.1定量分析基础Beer-Lambert定律低浓度下荧光强度正比于浓度线性范围通常跨越3-4个数量级检出限常达纳摩尔级别

4.2标准曲线法制作步骤系列标准溶液配制与测量注意事项避免内滤效应和仪器漂移误差分析评估线性区间和置信度

4.3内标法原理加入已知浓度内标物选择内标物与待测物性质相似计算方法基于信号强度比值

4.4加标法加标量荧光强度

4.5荧光淬灭分析静态淬灭形成非荧光复合物寿命不变动态淬灭碰撞引起能量损失寿命减小Stern-Volmer方程F?/F=1+Kq[Q]线性关系判断淬灭类型

第五章：化学发光基础化学能转化反应释放能量激发态形成产物分子获能光子释放激发态弛豫发光信号检测无需外部光源

5.1化学发光原理定义化学反应产生光子辐射能量转换过程化学能→电子激发能→光能与荧光的区别无需外部光源激发

5.2化学发光类型直接化学发光反应产物直接发光1间接化学发光能量转移给发光体2电化学发光电极表面反应发光3

5.3常见化学发光体系鲁米诺体系碱性条件下氧化发蓝光草酸酯体系过氧化物氧化发多色光吖啶酯体系高灵敏度标记物

5.4影响化学发光的因素pH8-10pH值影响反应速率和量子产率25°C温度改变反应动力学10??M催化剂金属离子或酶促进反应

第六章：化学发光仪器样品处理系统自动进样和混合检测系统高灵敏度光电转换信号处理系统数据采集与分析

6.1化学发光分析仪结构组成反应池、检测器、进样系统工作原理自动混合试剂产生光信号性能特点高灵敏度、宽线性范围

6.2流动注射化学发光系统系统构成蠕动泵、注射阀、反应管、检测器操作流程样品注入、试剂混合、信号检测应用优势高通量、低试剂消耗

6.3电化学发光仪器电极系统工作电极、参比电极、辅助电极电位控制精确施加电压或电流3信号采集同步光电信号记录

6.4生物发光测量仪器

第七章：化学发光分析方法1反应体系选择针对不同分析物样品前处理消除基质干扰定量方法应用从信号到浓度

7.1直接测定法1原理样品直接参与发光反应2操作步骤样品与试剂混合后立即测量3应用范围过氧化物、还原剂、金属离子

7.2动力学法初速度法反应初期发光强度测量防止产物抑制干扰积分法整个发光