刺五加叶发酵工艺优化及生物学活性评价.pdfVIP

摘要

刺五加叶作为药食同源植物刺五加的叶片，在畜牧生产中被作为饲料添加剂使用，

其含有黄酮、皂苷、多酚等多种活性物质，具有抗氧化、抗炎、降脂、降糖和保护神

经系统等功效。芽孢杆菌是微生态开发最早，种类最多，使用最广的益生菌，其产生

的水解酶可以补充动物肠道内源酶的不足，促进肠道营养物质的吸收。而发酵作为微

生物对中药加工的一种方法，不仅可以使药物中的有效成分释放出来，还可以增强其

原有特性或产生新的作用。本研究采用益生菌对刺五加叶进行液体发酵，通过响应面

法优化最佳发酵条件，并在此基础上对刺五加叶发酵前后的理化性质和抗氧化活性进

行分析，基于LC-MS/MS的代谢组学来分析刺五加叶发酵前后的变化，利用肠道菌

群分析发酵刺五加叶缓解抗生素相关腹泻小鼠的机理。

1.芽孢杆菌的分离鉴定及益生性能评价

从健康家鸽肠道中分离芽孢杆菌，并对其益生功能和安全性进行评价。通过菌落

形态，染色特性、生化试验和16srRNA进行鉴定，对其生长曲线、耐高温能力、耐

酸碱能力、耐胆盐能力、产酶能力以及在人工模拟胃肠液环境下的存活率进行筛选，

评价其益生性能；通过抗生素耐药性、菌株溶血性和小鼠安全试验对其进行安全性评

价。结果共分离到7株芽孢杆菌，筛选出3株益生性能和安全性较好的菌株，试验表

明，其在pH5~8液体培养基中生长良好；在65°C环境下培养10min存活率在30%

以上；在0.07%的胆盐环境下培养24h存活率在84%以上；在模拟胃肠液中培养3h

的存活率在42%以上；且均可产蛋白酶、α-淀粉酶和纤维素酶；对林可霉素不敏感；

无溶血现象；灌胃后的小鼠精神正常，脏器无病理性变化。

2.刺五加叶液体发酵优化及其发酵前后的成分比较

采用益生菌对刺五加叶进行液态发酵，并比较其发酵前后的物质变化和生物活性。

采用枯草芽孢杆菌LK和解淀粉芽孢杆菌M2混合发酵刺五加叶，通过单因素和响应

面法，以总多酚含量为指标，优化其发酵工艺。并采用LC-MS/MS进行非靶向代谢

组学分析，探究发酵前后的物质谱。结果显示最佳发酵工艺为：发酵时间54h、发酵

温度39.6°C、接种量2.5%(v/v)。在此条件下，多酚含量为82.69mgGAE/g，较发酵

前（41.50mgGAE/g）提高了41.19mgGAE/g。发酵后刺五加叶中多酚、黄酮含量以

及抗氧化活性显著高于发酵前。非靶向代谢组学分析共鉴定出1348种代谢物，其中

829为差异代谢物。分析显示共有13种多酚类和黄酮类差异代谢物与抗氧化活性呈

正相关；获得82条KEGG代谢通路，其中前25条通路中有2条通路与黄酮类化合

物有关。

3.发酵刺五加叶对抗生素诱导小鼠腹泻的缓解作用

通过连续4d灌胃盐酸林可霉素溶液建立抗生素相关性腹泻（AAD）小鼠模型。

后用刺五加叶水提液（400mg/mL）、刺五加叶发酵液低剂量（200mg/mL）、高剂量

（400mg/mL）治疗，观察并记录小鼠的生理指标和腹泻情况，对各组小鼠的盲肠粪

便16SrRNA基因V3-V4区域进行测序，综合评价刺五加对AAD小鼠模型的治疗作

用。结果表明，相比于模型组，刺五加叶发酵液和水提液均能提高小鼠的体重增量、

降低小鼠粪便湿重率，改善小鼠结肠长度。此外，测序结果显示盐酸林可霉素严重破

坏了小鼠肠道菌群平衡，降低了肠道菌群的相对丰度和多样性。刺五加叶发酵液灌胃

后小鼠肠道菌群的多样性增加，加速了AAD小鼠肠道菌群结构的恢复。

本研究通过筛选益生性能优良的芽孢杆菌对刺五加叶进行液体发酵，并进行发酵

工艺的优化。通过非靶向代谢组学技术分析发酵前后刺五加叶代谢物的变化，为刺五

加叶的开发利用奠定了良好的基础；利用AAD小鼠模型以及16SrRNA基因测序研

究肠道菌群的变化，分别从小鼠的生理指标和菌群多样性两方面综合评定刺五加叶发

酵液改善AAD小鼠肠道菌群的作用机制。

关键词：刺五加叶；益生菌；液体发酵；非靶向代谢组学；肠道菌群

ABSTRACT

AstheleavesofAsanthopanaxsenticosus,amedicinalplant,areusedasfeedadditives

inlivestockproduction,they